Characterizing systemic effects following spinal cord regeneration in adult zebrafish

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Taborda, Patrícia Naique
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/56487
Resumo: Tese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022
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spelling Characterizing systemic effects following spinal cord regeneration in adult zebrafishSpinal cord injuryMulti organ regenerationMating movementsFertilityZebrafishTeses de mestrado - 2022Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022Spinal cord injury (SCI) disrupts the communication between brain and body, leading to severe and permanent consequences for motor and sensory functions in mammals. Following the initial damage, where blood flow is disrupted and spinal hemorrhage occurs, a secondary cascade of events leads to scar formation, preventing axonal growth and re-enervation of the original targets. Consequently, tissue innervation is lost and changes in the neuroendocrine reflexes are induced, leading to long-term complications, such as autonomic dysreflexia or immunodeficiency, which increase patients’ morbidity. Unlike mammals, zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate the spinal cord following an injury, regaining their swimming behavior after 4 to 8 weeks. However, not all neurons have the same regenerative capacity and the effects that these lost axonal tracks can cause in the zebrafish remain unexplored. Therefore, the aim of this thesis was to study the effects that this incomplete reinnervation causes in the zebrafish, and whether these effects are dependent on the injury level. Here it is shown that rostral and caudal SCI are equally regenerated in zebrafish resulting in a recovery of their swimming capacity. In addition, we would argue that no major impairments in the immune response are observed in SCI regenerated zebrafish since they were able to regenerate organs (caudal fin and heart) that rely on the immune system to fully repair. Interestingly, male SCI regenerated zebrafish showed a lack of successful spawns and mating events. Although, no defects in anxious-like behavior and a normal gonad histology were observed. Taken together, our results suggest that the incomplete reinnervation might be the underlying cause of a subtle locomotor impairment which is essential, especially in males, for the control of the fine movements during mating.Uma lesão na medula espinhal (LME) quebra a conexão entre o cérebro e o corpo, levando a consequências severas e permanentes nas funções locomotoras e sensoriais em mamíferos. Depois do dano inicial, em que ocorre a disrupção do fluxo sanguíneo e hemorragia na medula espinhal, uma cascata de eventos secundários leva à formação de uma cicatriz que não permite o crescimento de axónios e a nova inervação dos tecidos-alvo. Consequentemente, a inervação dos tecidos é perdida, provocando mudanças nos reflexos neuroendócrinos, que levam a complicações a longo-termo, aumentando a morbilidade dos pacientes. Contrariamente aos mamíferos, o peixe-zebra (Danio rerio) tem uma capacidade excecional de regenerar a medula espinal após uma lesão, recuperando a função locomotora dentro de 4 a 8 semanas. No entanto, nem todos os neurónios têm a mesma capacidade regenerativa. Nomeadamente os axónios ascendentes e os axónios dopaminérgicos e serotonérgicos descendentes têm uma menor capacidade de crescimento. Em mamíferos, a perda de inervação depois de uma LME induz complicações sistémicas crónicas, tais como disreflexia autonômica ou imunodeficiência, que dependem do nível a que a LME foi sofrida. Em contraste, os efeitos que advêm da perda de ligações neuronais em peixe-zebra nunca foram explorados. Neste estudo pretendemos avaliar os efeitos de uma inervação incompleta nos peixes-zebra e se estes efeitos são dependentes do nível da lesão. Para isto, a medula espinhal (ME) de peixes-zebra com 3 a 12 meses de idade foi seccionada transversalmente a dois níveis diferentes, rostral (a 5 mm do tronco cerebral) e caudal (ao nível da barbatana dorsal). Como controlo foram usados peixes-zebra sujeitos a uma cirurgia semelhante, omitindo, no entanto, o passo em que se secciona a ME transversalmente. Subsequentemente, a recuperação dos movimentos natatórios foi avaliada através de um teste de campo aberto. Os peixes-zebra com LME tanto ao nível rostral como ao nível caudal, recuperaram a capacidade natatória após 8 semanas, alcançando níveis comparáveis aos dos controlos. Apesar dos peixes lesionados ao nível rostral terem mostrado uma tendência para uma pior capacidade natatória no seguimento da LME, nenhuma diferença significativa foi observada entre peixes com LME rostral ou caudal. Este resultado demonstra que o nível da LME não afeta a recuperação da capacidade motora em peixe-zebra. Após determinar o tempo necessário para recuperação da função motora, ou seja, 8 semanas após a LME rostral ou caudal, os peixes-zebra foram submetidos a uma lesão secundária. Após a cauterização da barbatana caudal, os peixes-zebra que regeneraram de uma LME, conseguem formar um blastema que, através da proliferação celular, dá origem a uma barbatana com o mesmo padrão e morfologia da original. Tanto a percentagem do crescimento regenerativo como a taxa de crescimento ao longo do tempo não mostraram diferenças entre os peixes que regeneraram de uma LME e os peixes controlo. Para além disso, a formação de bifurcações e a vascularização do tecido ocorreram normalmente, sem diferenças entre os dois grupos de peixes. Estudos anteriores mostraram que a resposta imunitária é essencial no processo regenerativo destes órgãos. Especificamente, a depleção de macrófagos após a amputação da barbatana caudal leva a uma deficiência na formação do blastema, na diminuição da proliferação celular e, consequentemente, na redução do crescimento da barbatana. Para além disso, estes também são essenciais na neoangiogenese no seguimento de uma ferida em larvas de peixe-zebra, e na neovascularização do coração após lesão. Como nenhum defeito descrito anteriormente foi observado, a resposta imunitária na sequência da cauterização da cauda não deverá estar alterada em peixes zebra que regeneraram após uma LME. No seguimento de uma ressecção do ápice ventricular, não foram observadas diferenças no tamanho e na percentagem de tecido cicatricial para peixes regenerados de uma LME a nível rostral ou caudal. Neste modelo regenerativo, a resposta imunitária também é essencial. Especificamente, a infiltração de macrófagos é importante para a deposição, mas também a remoção de colagénio e a sua depleção leva à redução da neovascularização do tecido, uma diminuição da proliferação de cardiomiócitos e, consequentemente, uma resolução tardia da cicatriz. Por isso, os resultados obtidos, sugerem novamente que a resposta imunitária nos peixes regenerados não estaria alterada. No entanto, mais estudos são necessários para reforçar esta conclusão. De modo a avaliar se as alterações nos neurónios monoaminérgicos poderiam afetar o comportamento tipo ansioso nos peixes que regeneraram de uma LME, usámos três testes comportamentais (o teste do tanque novo, o teste de preferência claro/escuro e o teste de campo aberto) no caso dos peixes com lesão rostral ou dois no caso dos peixes com lesão caudal (o teste do tanque novo e o teste de preferência claro/escuro). Estes não mostraram um aumento do comportamento tipo-ansioso quando comparados com os controlos. No entanto, o teste de campo aberto e o teste do tanque novo, revelaram a presença de uma deficiência locomotora subtil nos peixes-zebra que recuperaram de uma LME rostral. Em contraste, este défice não foi observado para peixes com LME caudal. Esta diferença não é surpreendente, uma vez que a lesão caudal é menos severa que a rostral, afetando uma menor parte do corpo do peixe. Após observar este defeito, um teste de acasalamento foi feito para avaliar o controlo dos movimentos finos. De modo a terem acasalamentos bem-sucedidos, os peixe-zebra têm de seguir uma sequência de passos coordenados entre a fêmea e o macho. Deste modo a oviposição pode ser sincronizada com a libertação do esperma, aumentando a probabilidade de fertilização. Vários fatores podem afetar este comportamento, revelando que quando estes passos não são seguidos, o sucesso na procriação é menor. Os resultados obtidos mostram que os peixes-zebra machos que regeneraram de uma LME têm um defeito no acasalamento. Especificamente, a maioria destes machos não tiveram um acasalamento bem sucedido. Para além disso, os acasalamentos bem-sucedidos de machos com LME caudal, resultaram num menor número de ovos postos pelas fêmeas, uma diminuição na percentagem de ovos fertilizados e na percentagem de embriões viáveis 24 horas pós fertilização (hpf). De modo a compreender melhor este défice, o comportamento de acasalamento de peixes-zebra que regeneraram de uma LME rostral ou caudal foi filmado e avaliado consoante o número de vezes e tempo que o casal passava a nadar com os corpos encostados um no outro (evento de acasalamento). Os resultados mostraram uma tendência dos peixes-zebra machos com LME para um baixo número de eventos de acasalamento quando comparado com os peixes controlo, no entanto esta diferença não foi significativa. Adicionalmente, a maioria dos peixes-zebra machos regenerados de uma LME não tiveram nenhum evento de acasalamento durante os 15 minutos em que foram gravados. Estes resultados sugerem que os peixes-zebra machos que recuperaram de uma LME têm um comportamento de acasalamento alterado, o que leva a um baixo nível de sucesso em procriar. Para além disso, a menor percentagem de ovos fertilizados e viáveis poderá ser devido à falta de sincronização da oviposição com a libertação do esperma. Para verificar se a histologia das gônadas dos peixes que regeneraram uma LME não estava alterada, uma coloração de hematoxilina e eosina (H&E) foi feita nas gônadas extraídas de machos e fêmeas 13 semanas pós LME rostral ou de controlos. Não se verificaram diferenças entre a histologia dos peixes-zebra regenerados da LME e a dos peixes-zebra controlo. Como esta análise foi apenas feita em peixes-zebra que regeneraram de uma LME rostral, seria importante fazer também para peixes com LME caudal, uma vez que apenas estes mostraram o defeito na fertilização e viabilidade dos embriões. Os defeitos observados poderão ser devidos a outros fatores, como um défice sensorial, uma deficiência locomotora ou uma desregulação hormonal que leva aos machos a alterarem o seu comportamento de acasalamento. No entanto, são necessários mais estudos para elucidar a razão por detrás deste défice. Concluindo, os resultados obtidos sugerem que a inervação incompleta após uma LME em peixes-zebra poderá ser a causa inerente de uma deficiência locomotora subtil que seria essencial, especialmente em machos, para o controlo de movimentos finos durante o acasalamento.Tomás, Carmen de SenaSaúde, Maria Leonor TavaresRepositório da Universidade de LisboaTaborda, Patrícia Naique2022-12-072025-12-30T00:00:00Z2022-12-07T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/56487TID:203144996enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:04:06Zoai:repositorio.ul.pt:10451/56487Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:07:01.286018Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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