Response to flucytosine in Candida glabrata at the membrane proteome level: role of the DHA family and the transcription factor CgPdr1

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pires, Carla Sofia Amorim
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/34572
Resumo: Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
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spelling Response to flucytosine in Candida glabrata at the membrane proteome level: role of the DHA family and the transcription factor CgPdr1Candida glabrataResistência ao fármaco flucitosinaProteoma de membranaAntiportadores droga: H+Teses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Candida glabrata é um fungo patogénico que emergiu nas últimas décadas como a segunda causa mais comum de candidíase em todo o mundo. O género Candida compreende quase duzentas espécies, a maioria das quais são omnipresentes em numerosos habitats naturais e artificiais. As espécies patogénicas de Candida são encontradas como comensais no trato oral, gastrointestinal e genital de hospedeiros saudáveis e têm a propensão de se tornar patogénicas quando o hospedeiro se torna imunodeprimido. As infeções causadas por esta levedura são caracterizadas por uma elevada mortalidade e morbilidade. Entre outros fatores de virulência, as espécies do género Candida exibem, em comparação com espécies não patogénicas, uma expansão de famílias de transportadores de enzimas extracelulares e transmembranares, bem como um enriquecimento em transportadores de superfície celular com o potencial de conferirem resistência aos fármacos por funcionarem como bombas de efluxo de drogas, prejudicando a eficácia das terapias antifúngicas. C. glabrata é filogeneticamente mais próxima da levedura modelo - Saccharomyces cerevisiae do que das outras espécies do género Candida. No entanto, é frequentemente a segunda ou terceira causa mais comum de infeções fúngicas, sendo que em populações como diabéticos e idosos chega a ser o fungo patogénico dominante. Em comparação com outras espécies, C. glabrata fornece um modelo promissor para o estudo da base genética da resistência a múltiplos antifúngicos. A resistência a múltiplos fármacos é definida como a aquisição simultânea de resistência a um grande espectro de substâncias químicas citotóxicas estrutural e funcionalmente não relacionadas, às quais o organismo nunca tinha sido exposto. Este fenómeno está a tornar-se um problema clínico crescente, uma vez que compromete a eficácia da terapêutica antimicrobiana. Para diminuir com sucesso o número de agentes patogénicos resistentes a múltiplos fármacos, é fundamental adquirir um conhecimento extenso dos mecanismos moleculares subjacentes à resistência aos fármacos antimicrobianos. Esta resistência a fármacos pode ser adquirida através de vários mecanismos: (I) alteração dos níveis de expressão e atividade de proteínas da membrana plasmática ou canais e transportadores de membrana; (II) degradação enzimática ou inativação dos fármacos; (III) ativação de sistemas de replicação e reparação de DNA; (IV) impedimento da entrada do fármaco na célula e/ou extrusão ativa do mesmo catalisada por transportadores transmembranares; (V) sequestro do fármaco em vesículas intracelulares; (VI) alteração ou modificação do alvo do fármaco. A ação de transportadores de membrana, incluindo bombas de efluxo da superfamília ATP-Binding Cassette (ABC) e transportadores da família Drug:H+ Antiporter (DHA), é fundamental para a resistência a múltiplos fármacos. Os transportadores ABC obtêm energia por hidrólise de ATP, enquanto que os transportadores DHA utilizam o gradiente de protões através da membrana plasmática para exportar compostos para fora da célula. O genoma de C. glabrata codifica 18 transportadores ABC, seis meios transportadores e 12 transportadores completos, dos quais seis pertencem à subfamília PDR (Pleiotropic Drug Resistance) e apenas alguns foram estudados para resistência a fármacos ou atividades de transporte; codifica ainda 15 transportadores DHA1 que codificam para proteínas DHA com 12 segmentos transmembranares. Desde a década de 1950 várias classes de drogas antifúngicas foram desenvolvidas, no entanto, apenas quatro deles são atualmente usados na prática clínica para tratar infeções por Candida: análogos de pirimidina, polienos, azóis e equinocandinas. A extensão da resistência aos fármacos antifúngicos varia para as diferentes classes de fármacos. Em espécies de Candida há resistência bastante limitada aos polienos e equinocandinas, enquanto que a resistência ao análogo de pirimidina 5-flucitosina e a azóis é mais comum. Neste trabalho foi estudado o efeito da exposição de células de C. glabrata ao fármaco antifúngico 5-flucitosina, ao nível do proteoma de membrana. Hoje em dia, novas abordagens quantitativas que utilizam a Espectrometria de Massa (MS) e a química estável de rotulagem de isótopos oferecem uma alternativa às técnicas tradicionais que empregam a eletroforese bidimensional comparativa para estudos de proteómica de expressão. A MS é uma ferramenta particularmente relevante no caso de proteínas de membrana, que não são detetáveis em géis bidimensionais, porque são em grande parte insolúveis em tampões de focagem isoelétrica. Neste trabalho, realizou-se análise proteómica de membrana baseada em iTRAQ-MS (isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification) para identificar e quantificar as proteínas associadas à membrana em células de C. glabrata cuja concentração se altera após exposição à 5-flucitosina (5-FC). Um total de 32 proteínas apresentaram diferenças de expressão na membrana depois de expostas a 5-FC, quando comparadas com células em condições controlo. Estas proteínas estão envolvidas nos seguintes processos biológicos: remodelação da parede celular, metabolismo lipídico, metabolismo de aminoácidos/nucleotídeos, componentes ribossomais e maquinaria de tradução, função mitocondrial, metabolismo da glicose e transportadores de membrana. Por comparação com as alterações que se verificam nas mesmas condições ambientais no mutante Δpdr1, com o gene PDR1 eliminado, observou-se que 50 % das proteínas cuja expressão se altera após exposição a 5-FC estão sob influência do fator de transcrição CgPdr1, que se verificou ser determinante na resistência à 5-FC por C. glabrata. Este resultado surpreendente é muito interessante, uma vez que o fator de transcrição CgPdr1 é o principal determinante de resistência a azóis em C. glabrata. A observação de que também poderá estar envolvido na aquisição de resistência a 5-FC sugere a existência de um mecanismo comum à resistência a duas famílias de antifúngicos, o que é preocupante na perspetiva da aquisição de resistência a agentes antifúngicos, sem necessidade de exposição prévia aos mesmos. Entre as proteínas encontradas com expressão aumentada encontra-se o transportador da família DHA - CgFlr1, que foi eleito para estudos posteriores. Foi estudado o papel do CgFlr1, e do seu homólogo CgFlr2, na resistência à 5-flucitosina. Os resultados obtidos demonstram que ambas as proteínas conferem resistência a 5-flucitosina. Adicionalmente, e apesar do seu elevado grau de homologia, CgFlr1 parece conferir resistência especificamente ao fungicida mancozeb, enquanto CgFlr2 parece conferir resistência a azóis e a anfotericina B. Verificou-se que a proteína CgFlr1 se localiza na membrana plasmática, quando expresso em C. glabrata, mas também quando expresso em S. cerevisiae, complementando o fenótipo de suscetibilidade a 5-FC exibido pelo mutante Δflr1. Verificou-se que a eliminação dos genes CgFLR1 e CgFLR2 leva a uma acumulação intracelular de 5-FC maior do que a registada em células da estirpe selvagem, o que sugere que estes transportadores desempenham um papel direto na resistência à 5-FC por expulsão desta droga antifúngica para o meio extracelular. No global, os resultados descritos neste estudo salientam a importância dos transportadores de múltiplos fármacos da família DHA no fenótipo de resistência a antifúngicos, em particular no que diz respeito a 5-FC. A caracterização dos transportadores CgFlr1 e CgFlr2 como estando envolvidos na resistência a 5-FC reforça a noção de que é necessário estudar os restantes membros desta família em C. glabrata, dado o seu provável impacto clínico. Adicionalmente, este estudo realça a importância do recurso a abordagens à escala do genoma, em particular ao nível do proteoma, na identificação e compreensão dos mecanismos de resposta e resistência a antifúngicos. Os processos biológicos e os seus efetores identificados no presente estudo representam alvos promissores para o desenvolvimento de novos sensitizadores da resistência à flucitosina, que poderão permitir a utilização terapêutica de 5-FC em mais baixas concentrações e sem riscos tão elevados de falência da terapêutica, limitando o desenvolvimento de resistência a 5-FC em C. glabrata que habitualmente acontece com elevada rapidez.Candida glabrata is pathogenic fungi that emerged in the last decades as the second most common cause of candidiasis worldwide. The infections caused by this yeast are characterized for a high mortality and morbidity, and the action of drug efflux pumps is impairing treatment effectiveness. Multidrug resistance has emerged in most organisms and poses a severe clinical problem for the treatment because the extensive use of antifungal drugs had led to a huge increase in the number of intrinsically resistant infections with fungal pathogens. Since resistance often relies on the action of membrane transporters, including drug efflux pumps from ATP-Binding Cassette (ABC) family or from the Drug:H+ Antiporter (DHA) family, an iTRAQ-based (isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification) membrane proteomics analysis was performed to identify all the membrane-associated proteins whose abundance changes in C. glabrata cells exposed to the Fluoropyrimidine drug 5-Flucytosine (5-FC). A total of 32 proteins were found to display significant expression changes in the membrane fraction of cells exposed to 5-FC, when compared to cells in the unstressed control conditions, 50 % of which under the influence of the transcription factor CgPdr1, found to be a determinant of C. glabrata resistance to 5-FC. These proteins cluster into functional groups associated to cell wall assembly, lipid metabolism, amino acid/nucleotide metabolism, ribosome components and translation machinery, mitochondrial function, glucose metabolism and multidrug resistance transport. Among the proteins whose concentration was found increased in 5-FC stressed cells, CgFlr1 was elected for further studies. The role of CgFlr1, and of its close homolog CgFlr2, in 5-FC resistance was assessed. Results obtained demonstrate that both proteins confer 5-FC resistance. Despite their high degree of homology, CgFlr1 seems to specifically confer resistance to the fungicide mancozeb, while CgFlr2 appears to confer resistance to azole antifungal drugs and amphotericin B. CgFlr1 was found to be localized in the plasma membrane in C. glabrata and when heterologously expressed in Saccharomyces cerevisiae, complementing the 5-FC susceptibility phenotype exhibited by the S. cerevisiae Δflr1 mutant. Additionally, the deletion of CgFLR1 and CgFLR2 was found to lead to increased intracellular accumulation of 5-FC, suggesting that these transporters play a direct role in the resistance to 5-FC by extruding this antifungal drug to the extracellular medium.Teixeira, Miguel Nobre Parreira CachoTenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade,1952-Repositório da Universidade de LisboaPires, Carla Sofia Amorim2018-08-23T11:37:04Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/34572TID:201988950enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:30:01Zoai:repositorio.ul.pt:10451/34572Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:49:18.215876Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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