Sparkling wine yeasts performance: integrated characterization during second fermentation
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| Data de Publicação: | 2013 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/10170 |
Resumo: | Tese de mestrado [versão pública]. Biologia (Microbiologia aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 |
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Sparkling wine yeasts performance: integrated characterization during second fermentationSaccharomyces cerevisiaeFermentaçãoVinhoTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado [versão pública]. Biologia (Microbiologia aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Sparkling wines are a distingué type of wine, very appreciated worldwide and with an important market value. Their production is based on a second alcoholic fermentation of a base wine. Invariably, Saccharomyces cerevisiae is chosen by wine-makers to perform such fermentation due to its unmatched qualities. Second fermentation process is associated to particular stress factors with which yeasts must cope. Ethanol presence (8-14%), temperatures below 16ºC or nitrogen starvation are among unfavorable conditions yeast must support and that ultimately can compromise the fermentation, delivering an unsatisfactory final product. The objective of this work was to study encapsulated sparkling wine yeasts’ physiological, cytological and molecular adaptation during an in-bottle process of second fermentation at very low temperatures and different concentrations of assimilable nitrogen. Two yeast strains were inoculated in conventional sparkling wine bottles at two different temperatures (10ºC and 12ºC) with two different assimilable nitrogen concentrations (100 mg/l and 56 mg/l), generating 8 fermentation conditions that mimic an actual industrial sparkling wine production. In order to study the physiological changes along the process an integrative and multiparametic characterization was made at specific time-points. For the purpose several yeast parameters were monitored: fermentation kinetics, viability, vitality, glycogen, trehalose, neutral lipids, glutathione, fatty acids, total proteins, ATP, relative expression of targeted stress genes and sensorial properties. Lower temperatures and low nitrogen showed to have a major impact on fermentation, with an influence on evaluated parameters and wine sensorial quality that was highly strain dependent. Strain SC1 was more robust, resilient and well-adapted to 10ºC fermentations, whereas strain SC2 revealed to be more active and plastic, producing higher quality wines at 12ºC. With the information gathered in this work, profitable adjustments in yeast production process are certainly expected, as well as design of new plans of study encompassing different strains and/or additional parameters.Os vinhos efervescentes são um tipo de vinho que se destaca pelas suas características únicas, muito apreciado mundialmente e com um considerável valor de mercado. O exemplar de excelência deste tipo de vinhos é o Champagne, produzido exclusivamente na região de Champagne, França e que é conhecido pelo seu enorme prestígio e paladar único. O processo de produção de um vinho efervescente passa pela realização de uma segunda fermentação alcoólica a partir de um vinho base, normalmente branco ou rosé. Este vinho base é obtido a partir de uma fermentação alcoólica em mosto da mesma forma que um vinho de mesa seria obtido. A principal diferença reside na adição posterior de vários compostos ao vinho base que irão ajudar a que a segunda fermentação decorra da melhor forma. Um concentrado de sacarose (também chamado de liqueur de tirage), azoto assimilável, taninos ou bentonite são exemplos de alguns aditivos que têm por função não só facilitar o processo fermentativo mas também contribuir para o seu sucesso. No centro de todo o processo está o microrganismo responsável pela segunda fermentação. Invariavelmente Saccharomyces cerevisiae é a levedura escolhida pelos produtores de vinhos efervescentes. Hoje em dia existem centenas de estirpes industriais, que foram sendo seleccionadas ao longo dos anos pelas suas características específicas, e são sem dúvida as mais aptas a realizar um processo tão exigente como o de segunda fermentação. Estas leveduras podem ser comercializadas sob várias formas como são exemplo as culturas líquidas e as leveduras secas activas, estas últimas subdivididas em livres ou encapsuladas. As leveduras encapsuladas foram recentemente introduzidas no mercado pela Proenol, uma empresa portuguesa que é neste momento líder mundial de mercado nesta área. Este tipo de leveduras apresenta várias vantagens sobre as outras formas, nomeadamente a eliminação do passo de sedimentação progressiva da levedura anterior à sua remoção e a possibilidade de inoculação directa (sem aclimatização), tudo sem que a levedura ou a qualidade do vinho sejam afectados. A aclimatização é um processo pelo qual as leveduras são gradualmente adaptadas às condições adversas que vão encontrar no vinho base quando forem inoculadas, como por exemplo a presença de etanol (8-11%) e baixas temperaturas (inferior a 16ºC). Ambos os processos mencionados (sedimentação progressiva da levedura e aclimatização) são demorados, dispendiosos e requerem trabalho extra, o que faz com que as leveduras encapsuladas sejam bastante atraentes para os produtores de vinho. Existem vários métodos pelos quais um vinho efervescente pode ser produzido, no entanto, o método tradicional (ou méthode traditionnelle) é conhecido por ser o método com o qual se conseguem produzir vinhos efervescentes de qualidade superior sendo desta forma o preferido por muitos produtores. Neste método, o fermentador utilizado é a própria garrafa que mais tarde será entregue ao consumidor final. Assim, garrafas contendo o vinho base são inoculadas com levedura, rolhadas e deixadas a fermentar em extensas caves ou adegas, o que pode levar cerca de um a dois meses dependendo das condições de fermentação. Após este período, o vinho é deixado em contacto com o depósito de leveduras num processo chamado de “envelhecimento” que pode ir de 9 meses a vários anos consoante a variedade de vinho que esteja a ser produzida. Apesar de a fermentação já ter terminado é nesta fase que o vinho adquire as suas principais qualidades organolépticas. Aminoácidos, manoproteínas e ésteres entre outros componentes celulares, são lentamente libertados para o vinho e vão ser responsáveis por apurar o aroma, paladar e o bouquet muito importantes neste tipo de vinhos. Finalmente, as garrafas são invertidas verticalmente, a levedura deposita e é removida por congelamento do gargalo da garrafa (dégorgement). Após o vinho final ser ajustado, as garrafas são novamente rolhadas, rotuladas e estão prontas para chegar ao consumidor final. Apesar de o processo de segunda fermentação ser vastamente conhecido e aplicado há vários séculos, este continua a desafiar os produtores que têm que se debater com vários problemas inerentes ao processo. O vinho base no qual as leveduras são inoculadas bem como as condições que se desenvolvem ao longo da fermentação tornam o processo inóspito do ponto de vista biológico. Elevado teor de etanol inicial (8-11%) que tende a aumentar 2-3% durante a fermentação, baixas temperaturas (menores que 16ºC), baixo pH (3,3 ou menos), desenvolvimento de stress oxidativo e osmótico, acumulação de CO2 e esgotamento de nutrientes são algumas das principais adversidades que as leveduras têm de ultrapassar durante o processo. Dos stresses mencionados, as baixas temperaturas são das que causam maiores problemas à fermentação. Por serem tão abaixo da temperatura óptima de crescimento de S. cerevisiae (25ºC a 28ºC), o seu metabolismo celular é de tal forma condicionado que algumas fermentações tornam-se vagarosas ou chegam mesmo a parar antes de terem sido completadas. Apesar de representarem um contratempo na fermentação, as baixas temperaturas são um “mal” necessário. Além de ser economicamente inviável manter as extensas caves ou adegas a temperaturas elevadas, aumentar a temperatura faria com que as fermentações ocorressem a um ritmo demasiado rápido e muitas características organolépticas típicas destes vinhos não teriam tempo para se desenvolver e seriam perdidas. Além da temperatura, a disponibilidade de azoto também tem sido apontada como outro parâmetro que pode comprometer a fermentação pois este elemento torna-se muitas vezes um factor limitante no decorrer da fermentação e é fundamental ao metabolismo celular. Dado que não existem muitos estudos que se debrucem sobre a temática do uso de leveduras encapsuladas em processos de segunda fermentação e sendo que questões como as que foram referidas anteriormente são centrais na produção de vinhos efervescentes, pareceu-nos pertinente realizar um estudo aprofundado que abordasse várias problemáticas associadas a este processo fermentativo e com isso conseguir novas e importantes informações sobre o mesmo. Desta forma, o objectivo deste trabalho passou por realizar um estudo exaustivo das alterações e adaptações fisiológicas, citológicas e moleculares ocorridas na levedura S. cerevisiae durante um processo de segunda fermentação à escala real, a baixas temperaturas e com variação do teor de azoto assimilável. Para tal, duas estirpes diferentes de S. cerevisiae encapsulada (aqui denominadas por SC1 e SC2 por razões de confidencialidade), produzidas e cedidas pela empresa Proenol, foram inoculadas no mesmo vinho base em garrafas de 750 ml. Previamente, o vinho base foi ajustado para duas concentrações diferentes de azoto assimilável (56 mg/ml e 100 mg/ml). As 4 condições (2 estirpes x 2 concentrações de azoto assimilável) foram ainda conjugadas com duas temperaturas diferentes (10ºC e 12ºC) gerando um total de 8 condições experimentais e que simulam possíveis fermentações industriais. De forma a poder acompanhar a evolução da fermentação e da levedura, 4 tempo amostrais ao longo da fermentação foram estabelecidos em função da pressão atingida. Assim, as células foram analisadas imediatamente antes da inoculação (pressão 0 bar – B0), no início (pressão 1 bar – B1), meio (pressão 3 bar – B3) e fim (pressão 5 bar – B5) da fermentação. Visto que a resposta e adaptação celular aos diferentes factores presentes não é dependente de apenas um processo biológico mas sim de vários e da sua interligação, a melhor estratégia para conseguir obter conclusões válidas e que conseguissem explicar essas alterações foi realizar uma análise multiparamétrica, integrativa e abrangente. Para tal, pela sua importância e potencial informação relevante, vários parâmetros celulares foram escolhidos para integrar esta análise do estado fisiológico, citológico e molecular das células: cinética de fermentação, viabilidade, vitalidade, trealose, glicogénio, lípidos neutros, glutationa, ácidos gordos, proteínas totais, ATP, expressão relativa de genes associados a diferentes stresses (HSP12, GSH1, TRX2 e GPD1) e propriedades sensoriais. A cinética fermentativa foi determinada pela pressão de CO2 acumulada nas garrafas e pela concentração de glucose + frutose no vinho. A pressão foi obtida através de aferómetros que foram colocados em garrafas piloto de cada condição e a concentração de glucose + frutose foi determinada pela empresa Proenol que colaborou no estudo. A viabilidade foi determinada por citometria de fluxo (FC) e azul de metileno (MB), apesar de no final apenas se ter usado os resultados relativos a FC devido à elevada correlação entre os dois métodos. Juntamente com a viabilidade, a vitalidade foi determinada por FC recorrendo a um kit comercial (baseado em dois corantes fluorescentes). O glicogénio, o principal carbohidrato de reserva, foi analisado por FC utilizando a acriflavina como corante fluorescente para a sua detecção. A trealose, um carbohidrato de reserva importante na resposta a vários stresses, foi determinada por FC usando um reagente fluorescente comercial. Os lípidos neutros, importantes reservas lipídicas e energéticas, também foram analisados por FC usando um reagente fluorescente comercial. Todos os parâmetros analisados por FC foram submetidos a análise de heterogeneidade da população. No caso da viabilidade e vitalidade esta análise foi feita por observação directa da distribuição dos seus histogramas gerados na análise por FC. No caso do glicogénio, trealose e lípidos neutros foi utilizado o coeficiente de variação robusto (RCV) das distribuições de fluorescência. A glutationa, uma molécula envolvida em várias funções mas cuja principal é a protecção oxidativa, foi determinada através do uso de uma sonda fluorogénica. A glutationa reduzida foi determinada e em seguida, para se poder determinar a glutationa oxidada, toda a glutationa foi reduzida através do uso da glutationa redutase, obtendo-se assim a glutationa total. A partir da glutationa total e reduzida, por dedução, foi determinada a glutationa oxidada. Os ácidos gordos, importantes constituintes da membrana plasmática e envolvidos nas importantes alterações desta, foram determinados por GC-MS após extracção celular e a devida esterificação. As proteínas totais dosearam-se pelo método do biureto após extracção celular. O ATP foi determinado a partir de um kit comercial baseado na conversão da luciferina em oxiluciferina pela enzima luciferase, a qual gera um sinal fluorométrico passível de ser medido. A expressão génica relativa de HSP12, GPD1, GSH1 e TRX2 foi determinada com recurso à técnica de qRT-PCR (PCR quantitativo em tempo real), utilizando o método ΔΔCT e aplicando a respectiva eficiência de amplificação de cada gene. A normalização da expressão relativa foi feita com a média da expressão dos genes 18S e ACT1, ambos considerados genes de referência. O cálculo da expressão relativa foi feito em relação ao B0 (respectivo de cada estirpe). HSP12 é um gene de resposta geral ao stress, GSH1 e TRX2 são genes envolvidos na resposta ao stress oxidativo e GPD1 na resposta ao stress osmótico. A análise estatística dos resultados foi feita com recurso à análise de variância (ANOVA) a 3 factores (ou 2 quando necessário) e à análise de componentes principais (PCA). No final do trabalho foi feita uma análise sensorial ao vinho final obtido em cada uma das 8 condições experimentais. Para tal, um painel de 5 provadores profissionais de vinho foram convidados a realizar a prova e a avaliar cada um dos vinhos segundo várias características organolépticas importantes neste tipo de vinho. No fim da prova foi atribuída uma classificação global a cada um dos vinhos revelando qual ou quais as condições que resultaram num produto final de maior qualidade. A realização deste estudo permitiu obter informações importantes acerca do processo de segunda fermentação feito à escala industrial. A obtenção de um vinho efervescente, neste caso pelo método tradicional, é de facto um processo bastante rigoroso e que impõe um elevado nível de stress às leveduras. Os vários parâmetros analisados revelaram uma forte adaptação por parte das leveduras e uma constante tentativa de contrabalançar as condições adversas presentes. O facto de a análise levada a cabo ser uma análise multiparamétrica e integrativa permitiu não só recolher importantes informações sobre cada um dos parâmetros individualmente mas também analisar o processo sob uma perspectiva global e observar as relações estabelecidas entre eles e as variáveis em estudo. Globalmente, a estirpe SC1 revelou ser a estirpe mais tolerante, robusta e resistente. Não só esta estirpe mostrou melhores resultados em parâmetros fundamentais como viabilidade ou percentagem de células metabolicamente activas, como também mostrou bons indicadores na acumulação de metabolitos celulares chave num processo de segunda fermentação. Maior teor de glicogénio, lípidos neutros ou ácidos gordos insaturados revelaram precisamente um maior poder de resiliência e estabilidade fundamentais num ambiente tão inóspito. Por sua vez, a estirpe SC2 apesar de menos robusta, revelou ser mais plástica, activa e igualmente capaz de levar a cabo uma segunda fermentação. Uma das principais características que esta estirpe revelou foi ter um maior poder fermentativo que a estirpe SC1 em quase todas as condições experimentais. Adicionalmente, a estirpe SC2 mostrou ainda indicadores de uma maior actividade celular e capacidade de resposta ao stress. Maior actividade esterásica, maior acumulação de trealose (um importante metabolito de resposta ao stress) e de ATP, e finalmente uma maior expressão génica ao nível de alguns genes ligados ao stress, revelam um forte poder adaptativo e de resposta às várias condições adversas. Além das diferenças observadas entre estirpes também foi possível confirmar a forte influência das baixas temperaturas no processo fermentativo. Uma simples diminuição de 2ºC (de 12ºC para 10ºC) foi suficiente para tornar as fermentações lentas e com uma duração de cerca de 120 dias (o dobro esperado para uma segunda fermentação). Na base desta influência negativa esteve uma diminuição na viabilidade, actividade metabólica, acumulação de alguns metabolitos (glutationa e ácidos gordos) e expressão génica que no final levaram a uma diminuição drástica da cinética fermentativa. De uma forma geral, ambas as leveduras foram bem-sucedidas nas diferentes fermentações e deram provas de estarem aptas para levarem a cabo segundas fermentações em severas condições. Contudo, nas condições em que este ensaio foi realizado, 10ºC poderá ser uma temperatura demasiado baixa e que pode comprometer o sucesso do processo fermentativo. Relativamente à terceira variável, a disponibilidade de azoto assimilável, o seu impacto foi menos notório relativamente às outras duas. No entanto, dada a importância deste nutriente no metabolismo celular, a aplicação de uma baixa concentração de azoto assimilável levou a uma diminuição da cinética fermentativa (mais evidente nas fermentações realizadas a 12ºC), à diminuição da actividade esterásica e menor acumulação de alguns metabolitos importantes tais como glicogénio, trealose e lípidos neutros, revelando assim a sua importância adicional aquando da realização de um processo de segunda fermentação. Ao longo da fermentação as populações de células revelaram heterogeneidade nos teores de trealose e lípidos neutros, muito provavelmente por estes metabolitos estarem ligados à resposta ao stress e portanto estarem mais facilmente sujeitos a flutuações dentro da mesma população. Por sua vez, viabilidade, vitalidade e glicogénio revelaram maior homogeneidade, apenas com ligeiras variações, indicando uma maior consistência no decorrer da fermentação. Na análise em componentes principais (PCA) observou-se uma grande variação e dispersão das amostras, evidenciado pelo poder explicativo obtido com 3 componentes principais (apenas 58,9%). Na primeira componente principal (PC1) as amostras separam-se principalmente pela evolução de parâmetros de resposta ao stress (trealose, ATP e expressão relativa de HSP12, GSH1, TRX2 e GPD1. Já as componente principais PC2 e PC3 foram ambas explicadas pela variação dos parâmetros de viabilidade e vitalidade, estando também associadas à variação de glucose + frutose, lípidos neutros e proteínas totais (PC2) e à variação da saturação dos ácidos gordos (PC3). Foi possível observar uma maior dispersão da estirpe SC2 no conjunto destes planos, bem como uma maior restrição e homogeneidade resultante de temperaturas mais baixas (10ºC) em ambas as estirpes. No final, apesar das diferenças encontradas entre as estirpes ao longo da fermentação, ambas tiveram uma boa performance fermentativa, equivalente e passível de ser aplicada a uma escala industrial. Da mesma forma, ambas as estirpes revelaram a capacidade de produzir vinhos efervescentes com elevada qualidade e que embora com características diferentes, obtiveram classificações organolépticas muito próximas. Com isto conclui-se que seria erróneo afirmar que a estirpe SC1 ou SC2 é melhor, sem antes conhecer as condições em que a segunda fermentação se vai realizar. Cada uma revelou vantagens e melhores resultados dependentes das condições em que fermentaram e portanto será sem dúvida um factor a ter em conta no momento da escolha de uma estirpe de levedura. O factor temperatura, apesar de ter um impacto negativo a nível celular e metabólico, revelou ser importante nas características organolépticas finais do vinho. Finalmente, a maior concentração de azoto assimilável revelou ter um impacto global positivo no produto final embora durante a fermentação tenha sido a variável que menos influência teve sobre o comportamento e evolução das leveduras.Tenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952-Repositório da Universidade de LisboaFerreira, David José Moreira, 1988-2014-01-17T19:40:05Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/10170engmetadata only accessinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:55:15Zoai:repositorio.ul.pt:10451/10170Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:34:11.299972Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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