Engineering low-noise gene expression systems for single-molecule experiments

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, João Pedro Nunes
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/36294
Resumo: Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018
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spelling Engineering low-noise gene expression systems for single-molecule experimentsAutorregulação negativaSistema bicistrónicoRedução de ruídoSistema de dois plasmídeosTeses de mestrado - 2018Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018A heterogeneidade observada na natureza é muitas vezes desfavorável para experiências de microbiologia ou de biologia sintética, altamente influenciadas pela plasticidade genética das populações. Para este tipo de experiências é importante minimizar a variabilidade, ou seja, diminuir o ruído entre células da mesma população. O ruído pode ser definido como a soma de fatores intrínsecos, que interferem na expressão de um gene de interesse como por exemplo a transcrição e tradução, e de fatores extrínsecos, como por exemplo as taxas de transcrição ou a quantidade de proteína expressa. Por outro lado, para experiências que envolvam expressão de proteínas é importante desenvolver um sistema que possibilite um controlo dessa mesma expressão, diminuindo o ruído. Apesar da identificação destes problemas, atualmente muitos investigadores preferem utilizar sistemas menos apropriados com altos níveis de ruído entre outros problemas facilmente solucionáveis. O objetivo principal deste trabalho é a caracterização e utilização de sistemas com baixo ruído e expressão controlada de proteínas de modo a possibilitar a criação de um sistema de dois plasmídeos capaz de expressar independentemente dois genes com níveis reduzidos de ruído. Foram testados vários sistemas que contêm algumas características capazes de contornar estes problemas como a autorregulação negativa, transcrição bicistrónica e ainda a adição de diferentes promotores constitutivos de modo a diminuir a extensão da expressão proteica. Todos os plasmídeos foram testados em Escherichia coli utilizando microscopia e citometria de fluxo como ferramentas de caracterização do ruído e da expressão proteica. Indutores de expressão proteica como a tetraciclina e um análogo (ATc) foram testados de forma a testar os níveis de níveis de indução da expressão de proteína e o ruído. Com a tetraciclina, apesar de se esperar que o ruído induzido fosse menor uma vez que o ATc se liga mais fortemente ao promotor, resultou num maior ruído. Mais testes com concentrações de indutor menores têm de ser feitos. Para todos os sistemas com promotor PLLTetO-1 foi utilizado ATc como indutor uma vez que nas concentrações mais elevadas testadas a tetraciclina torna-se bastante tóxica para as células. Foram também testados dois plasmídeos com número de cópias diferente (pZH509 e pJS101). Ambos os plasmídeos contêm o mesmo sistema de expressão proteica em que uma proteína de interesse e um repressor são traduzidos do mesmo mRNA, neste caso GFP e TetR foram testados. Os resultados permitiram concluir que mesmo com plasmídeos com número de cópias diferente as diferenças a nível de ruído são diminutas apesar da grande diferença nos níveis de expressão da proteína. As grandes variações ao nível da expressão proteica são muito provavelmente causadas pela diferença no número de cópias dos plasmídeos e o ruído mais elevado a elevados níveis de indução observado para pZH509 deve-se ao facto de o sistema, nesses níveis de indução, poder passar de um estado regulado para um estado não regulado. Contudo, o plasmídeo pJS101 pode substituir o plasmídeo pZH509 se forem usadas concentrações maiores de indutor. Dois sistemas idênticos ao anterior (pJS102 e pJS103), mas com a variante de possuírem LacI enquanto repressor e com diferentes promotores entre si (PLLacO-1 e PLLacOsym respetivamente) foram também construídos e analisados. No caso do plasmídeo de pJS102 conclui-se que a curva de indução é próxima à do sistema Tet e que o ruído é também idêntico apesar de se verificar o mesmo problema acima referido de expressão proteica muito díspar. O outro sistema não funcionou como esperado uma vez que apresentou uma grande repressão do promotor levando a baixa expressão de GFP e a altos níveis de ruído. Os resultados obtidos sugerem que a energia de ligação do repressor a este promotor poderá ser mais forte impedindo que este se desassocie levando a crer que maior concentração de indutor não iria alterar os níveis de expressão. Contudo não existem modelos matemáticos que considerem dois locais de ligação de repressor, que é o caso de pJS103, e, portanto, mais estudos teriam de ser feitos para podermos confirmar esta hipótese. Com esta experiênciaconfirma-se que sistemas de autorregulação bicistronica baseados em LacI podem substituir sistemas que utilizem TetR. Foram testados ainda três promotores constitutivos (pJS23103, pJS23105 e pJS23106) inseridos anteriormente ao gene que codifica o repressor. Desta forma, seria expectável que uma expressão constitutiva do repressor diminuísse expressão basal de GFP. A hipótese inicial era a de que um promotor com 40% da força do promotor Tet seria ideal para que se obtivesse um ruído baixo a níveis intermédios o que não se observava para o pZH520 e ao mesmo tempo um intervalo de níveis de expressão maior que o observado para pZH509. As forças relativas dos promotores eram de 1%, 24% e 47% respetivamente, mas não foram comparados à força do promotor Tet não permitindo saber se algum corresponderia aos 40% acima referidos. Apenas pJS23103 mostrou potencial de melhoria de extensão dos níveis de expressão proteica, mas propõe-se que sejam testados mais promotores com forças compreendidas entre a do promotor pJS23103 e do promotor pJS23105. O plasmídeo pZH713 (idêntico ao plasmídeo pJS102) apresenta a expressão da proteína PP7cp em fusão com SYFP2 (em detrimento da GFP)foi utilizado para que se obtivesse o intervalo de indução de IPTG que permite a ligação do PP7cp às repetições PP7, observável acima do ruído de fundo. Concluimos que o intervalo de indução mais adequado situa-se entre os 5 e os 40 μM. Este plasmídeo foi também utilizado para detetar moléculas de mRNA individuais com a técnica de hibridização in situ de fluorescência de moléculas individuais uma vez que esta permite deteção e quantificação de mRNAs específicos. Contudo, apresenta alguns problemas como o facto de apenas ser possível utilizá-la em células fixadas. A estirpe Escherichia coliMG1655, que contém um inserto (ISB0072) com um gene que codifica mVenus-Cro e ainda vinte e quatro repetições de PP7 foi utilizada nesta experiência. Este inserto foi testado em trabalhos anteriores e expressa mRNAs individuais. Assim, foi possível observar que a localização da proteína correspondia à localização das repetições tanto no mRNA expresso a partir do plasmídeo como do mRNA expresso a partir do cromossoma. Os dados obtidos apontam para que se tenham observado mRNAs individuais e uma boa correlação entre PP7cp e as repetições em PP7. Baseados nos sistemas acima testados, dois plasmídeos foram criados (pZH740 e pZH742) e co transformados em Escherichia coliMG1655. O objetivo da criação deste sistema é que o mesmo permitisse exprimir controladamente dois genes, em simultâneo, em populações heterogéneas, com níveis de ruído iguais ou menores que o de genes constitutivamente expressos a partir de cromossomas (limite de ruído extrínseco) ao mesmo tempo reduzindo problemas de agregação de proteínas. O plasmídeo pZH740 permite a expressão da proteína Pf3 que possui um N-terminal que se liga à membrana e um C-terminal que fica sempre virado para o citoplasma enquanto pZH742 permite a expressão da proteína PP7. Com este sistema foi possível exprimir independentemente duas proteínas distintas. No futuro, a proteína Pf3 será usada para facilitar a contagem de proteínas uma vez que se liga à membrana celular permitindo assim comparar a expressão proteica ao número de mRNAs transcritos. O objectivo é obter a expressão de uma proteína por mRNA. Mais testes são necessários fazer ao sistema de dois plasmídeos, mas prevê-se a possibilidade de o estender para a expressão de três proteínas utilizando uma origem de replicação, um repressor e respetivo indutor e uma seleção de antibiótico diferentes.Natural heterogeneity is often unfavorable in microbiological or synthetic biology experiments. Thus, lower noise in cells populations can be beneficial. For example, low noise can be useful in experiments involving protein expression. In this manuscript, we present systems capable of solving those problems. Several plasmids using bicistronic autoregulation of GFP expression were tested. First, we found that noise was similar for compatible plasmids with different copy numbers, although they exhibited different protein expression levels. Second, we analyzed two analogous systems with either lactose or tetracycline repressors controlling gene expression. We concluded that noise is low for both systems. A plasmid with stronger lactose repressor binding did not work well, showing that repression strength is a key parameter for this type of gene expression system. Third, three constitutive promoters were tested to try to decrease uninduced GFP expression. One weak promoter showed potential for improving the dynamic range of protein expression. We propose that promoters with intermediate strengths should be tested. Finally, our new plasmids were applied for imaging single mRNA molecules in living E. coli cells. The system based on the lactose repressor was used to express fluorescent proteins that bound mRNA molecules containing tandem repeats. Induction was varied to achieve single mRNA imaging, verified by an independent hybridization method for mRNA imaging. Correlation was observed between mRNAs detected by fluorescent protein binding and hybridization. An mRNA detection plasmid based on this lactose repressor system was co-transformed with another, compatible plasmid that is independently controlled by the tetracycline repressor. With this two-plasmid system, we can now express two different genes independently with low noise. We anticipate the possibility of extending this principle to three proteins.Hensel, ZachFigueiredo, Andreia Cristina Silva Viegas Mata, 1980-Repositório da Universidade de LisboaSilva, João Pedro Nunes2019-01-09T11:58:26Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36294TID:202186750enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:32:51Zoai:repositorio.ul.pt:10451/36294Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:35.137131Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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