Analysis of the neutral and adaptive genetic variation of Colletotrichum kahawae and its relationship with the C. gloeosporioides complex

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Diogo Nuno Proença Rico
Data de Publicação: 2010
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/3316
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
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spelling Analysis of the neutral and adaptive genetic variation of Colletotrichum kahawae and its relationship with the C. gloeosporioides complexCaféCoffea spp.FilogenéticaTeses de mestrado - 2010Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010O café é uma dos produtos mais comercializados em todo o mundo, contribuindo significativamente para a economia de mais de 60 países tropicais. A sua importância a nível económico e social é patente quando se considera que centenas de milhões de pessoas dependem, directa ou indirectamente, do rendimento que esta industria lhes fornece para garantir o seu bem-estar e qualidade de vida. No entanto, a sua produção pode ser extremamente sensível a distúrbios provenientes de factores extrínsecos, tal como as doenças fúngicas, e as consequências que daí advêm acarretam efeitos socioeconómicos devastadores para muitos dos países produtores. Por outro lado, a maioria das variedades de cafeeiro actualmente cultivadas em todo o mundo, resultam de um recente período de domesticação que, apesar de ter permitido a criação de variedades extremamente produtivas e de alta qualidade, diminuiu grandemente a variabilidade genética das suas populações. Em termos práticos, tem-se reconhecido cada vez mais que este evento homogeneizador fomenta a emergência e disseminação de agentes patogénicos, facilitando a sua adaptação e transmissão entre hospedeiros. Deste modo, e dada a crescente ameaça que as doenças causadas por estes agentes patogénicos estão a gerar, torna-se essencial que as estratégias para o seu controlo incluam a maior quantidade possível de informação no que toca aos aspectos evolutivos e demográficos desses agentes, analisando as assinaturas deixadas na estrutura das suas populações e que se reflectem na variação neutral e adaptativa na A antracnose dos frutos verdes do cafeeiro, conhecida como Coffee Berry Disease, é uma devastadora doença que Coffea arabica, a espécie de cafeeiro mais importante e valiosa no mercado. Esta doença, causada pelo fungo Colletotrichum kahawae, é relativamente recente, tendo sido documentada pela primeira vez no Quénia em 1922. Desde então, tem-se disseminado por todos as regiões onde o cafeeiro Arábica é cultivado no continente Africano, onde ainda hoje se encontra confinada. No entanto, uma vez que esta doença é dada como o principal factor limitativo na produção de café Arábica neste continente, o receio da sua dispersão para outros países produtores, particularmente para América Latina, é motivo de grande preocupação. Vários estudos têm sido realizados na perspectiva de entender como é que C. kahawae surgiu e como é que as suas populações estão estruturadas, de maneira a retirar informação acerca do seu potencial patogénico, assim de como essas populações evoluíram e dispersaram ao longo do tempo e do espaço. No entanto, apesar do esforço empreendido, este agente patogénico tem revelado uma variabilidade genética extremamente baixa, o que até agora tem limitado possíveis inferências acerca da sua história evolutiva. Deste modo, a maioria da informação que se tem acerca da sua origem e disseminação baseia-se em dados históricos. Duas razões principais têm sido invocadas para explicar a uniformidade genética de C. kahawae. Em primeiro lugar, supõe-se que tenha tido uma origem recente do grupo de espécies próximo, C. gloeosporioides, e três hipóteses têm sido propostas nas quais a sua emergência terá ocorrido através de: 1) mutação a partir de uma linhagem ligeiramente patogénica de C. gloeosporioides existente em cafeeiros Arábica; 2) hibridação entre duas linhagens de C. gloeosporioides presentes nas espécies parentais de C. arabica, como C. canephora ou C. eugenioides; 3) transferência de uma das espécies parentais de C. arabica, onde estaria presente como saprófita, para se tornar um agente patogénico agressivo no cafeeiro Arábica quando este foi reintroduzido no continente africano para fins comerciais. No entanto, C. gloeosporioides é um complexo de espécies extremamente abrangente, que ocorre em mais de 1800 espécies vegetais, e tem permanecido taxonomicamente mal descrito, pelo que a simples afirmação da sua proximidade com C. kahawae traz muito pouca informação. Deste modo, a questão mais relevante que se coloca é de que linhagem dentro deste complexo terá surgido C. kahawae. A segunda razão diz respeito à assexualidade de C. kahawae. A ausência de fase sexuada, quer em meio de cultura, quer no campo, associada à sua estrutura populacional aparentemente clonal, têm sido mencionadas como evidências sugestivas da assexualidade desta espécie, embora inconclusivas. Neste aspecto, uma análise complementar útil e que tem levado a uma informação mais completa sobre o modo sexual de várias espécies de fungos, tem sido a investigação da evolução molecular dos genes que regulam a reprodução sexual, designados genes MAT, entre espécies próximas, tal como C. kahawae e C. gloeosporioides. Por outro lado, o género Colletotrichum possui um sistema genético de reconhecimento sexual único em todo o reino dos fungos, e cujo conhecimento acerca da evolução destes genes tem permanecido desconhecido. Neste trabalho, recorrendo a várias ferramentas laboratoriais e analíticas da biologia molecular, pretendeu-se cumprir dois amplos objectivos. Em primeiro lugar, desenvolver novos marcadores moleculares mais informativos do ponto de vista filogenético e filogeográfico, que pudessem ser postos em prática para concretizar o segundo objectivo, de desvendar não só as relações filogenéticas entre isolados de C. kahawae e de C. gloeosporioides, mas também a diversidade genética e estrutura populacional de C. kahawae, de maneira a se poderem realizar inferências acerca da sua origem e dispersão. Neste trabalho foi conseguido com sucesso o desenvolvimento de seis novos marcadores moleculares na região genómica Apn1/MAT, que se revelaram extremamente variáveis e mais informativos que os marcadores tradicionalmente usados. Usando uma amostragem representativa de 22 isolados de várias espécies dentro do complexo C. gloeosporioides e incluindo C. kahawae, aplicaram-se estes novos marcadores, verificando-se que o aumento do nível de resolução das relações evolutivas entre espécies, e até entre populações, era extremamente significativo. Um dos marcadores desenvolvidos, que compreende uma região inter-génica, revelou um potencial singular em termos informativos, permitindo por si só uma inferência filogenética equivalente à concatenação de sete marcadores. Por outro lado, uma vez que o tempo de divergência entre várias espécies próximas dentro de complexos tende a ser muito reduzido, detectou-se ainda uma presença acentuada do fenómeno de lineage sorting incompleto, que tem como uma consequência a discordância entre as topologias das árvores filogenéticas reconstruídas a partir dos vários marcadores utilizados. Salienta-se deste modo, ser essencial o uso de marcadores de vários loci no genoma para a resolução deste problema. Com base na selecção dos loci mais variáveis, analisou-se um total de 85 isolados, compreendendo uma extensa amostragem de isolados provenientes de uma vasta área onde C. kahawae é encontrado, assim como uma selecção representativa de isolados de C. gloeosporioides de Coffea spp. e de outros hospedeiro. Utilizando um conjunto de seis marcadores moleculares (ITS, β-tub2, ApMAT, Apn15L, MAT1-2-1 e MAT5L) e recorrendo a abordagens analíticas filogenéticas e filogeográficas, os resultados obtidos revelaram uma divergência muito superior ao esperada entre C. kahawae e isolados de C. gloeosporioides de cafeeiros, o que não suportava a hipótese de uma origem recente. Por outro lado, uma linhagem de C. gloeosporioides proveniente de Mangifera indica apresentou uma relação filogenética extremamente próxima com C. kahawae, ainda que biologicamente fosse uma espécie distinta devido à sua incapacidade de causar sintomas de antracnose nos frutos verdes. Estes dados sugerem que o agente patogénico, C. kahawae, possa ter emergido saltando de um hospedeiro diferente para os cafeeiros, ao contrário do pensamento corrente em que C. kahawae evoluiu e emergiu do género Coffea. Por outro lado, foi também possível desvendar alguma variação genética dentro de C. kahawae, distinguindo-se três grupos de haplótipos que estavam intimamente relacionados e estruturados de acordo com a sua distribuição geográfica. Reconstruindo o estado ancestral desses três grupos e com base na amostragem utilizada, verificou-se que o grupo da região Angolana era o mais ancestral, enquanto os isolados do Quénia e de outras regiões do Este Africano eram derivados desse grupo. Estes resultados vêm contrariar a ideia actual da origem de C. kahawae centrada no Quénia e sugerem uma hipótese alternativa, que aparentemente não é suportada e dificilmente seria prevista à luz dos dados históricos disponíveis. No entanto, a origem assumida para C. kahawae baseia-se na premissa de que este emergiu a partir de espécies de cafeeiros, o que pode não corresponder à realidade e que de alguma forma fornece uma possível explicação para o padrão evolutivo encontrado no nosso estudo. Finalmente, com a mesma amostragem, foi realizada uma análise da evolução molecular do gene MAT, MAT1-2-1, baseada em modelos estatísticos de máxima verosimilhança (Maximum likelihood), que se revelou que este gene parece estar sob uma intensa selecção purificadora, possivelmente devido a uma função biológica importante. Apesar disso, dois haplótipos separados por uma mutação não-sinónima foram encontrados nos grupos de C. kahawae, revelando a inesperada presença de duas proteinas diferentes ao nível da sequência de aminoácidos numa espécie tão geneticamente uniforme. Apesar de não se conseguir excluir a hipótese uma variação fenotípica neutral, este evento pode sugerir que esta proteína tenha um papel adaptativo a nível populacional dentro de C. kahawae. No geral, este trabalho cumpriu os objectivos a que foi proposto, revelando resultados inesperados e que irão certamente requerer uma investigação futura para apurar as hipóteses aqui levantadas. Espera-se assim que ele venha a ter impacto na comunidade científica interessada nesta doença e agente patogénico e que venha a estimular futuros estudos e trabalhos na biologia evolutiva deste agente patogénico, tão relevante ao nível económico e social. No geral, este trabalho cumpriu os objectivos propostos, revelando resultados inovadores e inesperados, particularmente na origem do agente patogénico estudado, e que irão certamente requerer uma investigação futura para apurar as hipóteses aqui levantadas. Espera-se assim que ele venha a contribuir para o aumento do conhecimento e que seja útil para a comunidade científica interessada nesta doença e agente patogénico, tão relevante a nível económico e social.In this work, a range of phylogenetic, phylogeographic and statistical methods of molecular evolution were used to investigate the evolutionary biology of an emergent pathogen in coffee crops (Coffea spp.), Colletotrichum kahawae. C. kahawae was first reported in Kenya, 1922, and causes severe disease (Coffee Berry Disease) in Arabica coffee throughout the African continent, where it is still restricted. However, the origin and spread of this pathogen has hitherto relied on historical data, and molecular studies have not been able to unearth enough genetic variation to infer about these processes, possibly due to its putative asexual nature and assumed recent evolution from Coffea spp. inhabiting strains of the C. gloeosporioides complex. To address this issue, a set of molecular markers was successfully developed, including a mating-type gene (MAT1-2-1), showing a greater informative potential than traditional markers. The most valuable markers were selected and used to analyze a representative sampling of C. kahawae, throughout most of its range, and C. gloeosporioides, mainly from Coffea spp. worldwide. Unexpectedly, the obtained results from the evolutionary relationships between C. kahawae and C. gloeosporioides suggest that the former may have emerged through a hostshift from hosts other than Coffea spp.. Moreover, the phylogeographic analysis of C. kahawae revealed a geographically structured population and the Angolan group as the most ancestral state inferred. Although our results come in opposition to the current Kenyan hypothesis and are not supported by the historical reports, the prevailing view follows the premise that C. kahawae evolved from Coffea spp., which our data suggests otherwise. Regarding the molecular evolution of MAT1-2-1, our results suggest a possible adaptive role within C. kahawae populations, due to the presence of two haplotypes in a highly conserved gene. These results have significantly contributed to fill a void in the current knowledge of the evolutionary biology of this pathogen and will hopefully stimulate further research.Paulo, Octávio, 1963-Castro, Dora Cristina Vicente Batista Lyon deRepositório da Universidade de LisboaSilva, Diogo Nuno Proença Rico2011-05-05T17:36:41Z20102010-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/3316enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:43:45Zoai:repositorio.ul.pt:10451/3316Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:29:17.197356Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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