Role of SNARE-dependant gliotransmitter release by astrocytes on the modulation of synaptic plasticity by BDNF
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| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/33235 |
Resumo: | Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017 |
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Role of SNARE-dependant gliotransmitter release by astrocytes on the modulation of synaptic plasticity by BDNFAstrócitosLTPBDNFdn-SNAREGliotransmissãoReceptores A2A de adenosinaTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017Os astrócitos são um dos quatro tipos de células da glia que podemos encontrar no Sistema Nervoso Central (SNC), sendo os outros três a microglia, os oligodendrócitos e as células NG2 positivas. Os astrócitos são o tipo de célula da glia mais abundante no SNC, sendo responsáveis por numerosas e complexas funções essenciais para bom funcionamento neuronal, através da sua ação sobre a transmissão sináptica e excitabilidade neuronal e sobre o processamento da informação transmitida pelos circuitos neuronais. Estas células têm também a capacidade de executar numerosas funções de suporte neuronal, colaborando no suporte trófico dos neurónios, nos processos de sobrevivência e diferenciação neuronal, no crescimento neurítico, em processos de manutenção da eficiência sináptica, e regulação das concentrações extracelulares de iões, contribuindo assim para a homeostasia do cérebro. Os astrócitos desempenham grande parte das suas funções através da libertação de mensageiros neuroactivos, denominados gliotransmissores. Os principais gliotransmissores são o glutamato, a adenosina trifosfato(ATP), a D-Serina, o brain-derived neurotrophic factor (BDNF) e também o tumor necrosis factor alpha (TNF-α). A libertação destas moléculas para a fenda sináptica e as interações resultantes entre estes gliotransmissores com os seus recetores, localizados tanto a nível pré como pós-sináptico, levam à modulação da atividade sináptica. O modelo que descreve o mecanismo de comunicação bidirecional entre astrócitos e neurónios denomina-se de sinapse tripartida. Este modelo propõe que após a libertação de neurotransmissores/neuromoduladores para a fenda sináptica pelo neurónio pré-sináptico, estes mesmos neurotransmissores/neuromoduladores irão ligar-se não só aos seus recetores a nível do neurónio pós-sináptico mas também ao nível dos seus recetores específicos que se encontram ao nível da membrana plasmática do astrócito que envolve a sinapse. Os astrócitos possuem inúmeros tipos distintos de recetores para os vários neurotransmissores/neuromoduladores ao nível da sua membrana plasmática, pelo que podem assim desencadear respostas consoante os neurotransmissores/neuromoduladores que são libertados. A ligação destas moléculas aos respetivos recetores astrocitários podem desencadear um aumento da concentração intracelular de Ca2+. O aumento da concentração intracelular deste ião leva à libertação de gliotransmissores para a fenda sináptica, permitindo fenómenos de modulação da atividade sináptica. As sinapses possuem plasticidade que varia consoante a sua atividade, sendo que este mecanismo tem um papel vital no desenho das conexões sinápticas, particularmente durante o período de desenvolvimento. Esta plasticidade, num entanto, também se encontra presente no cérebro adulto, sendo aceite que a formação de memórias se baseia em alterações da eficiência sináptica que fortalecem as associações entre neurónios comunicantes, o que por sua vez permite o armazenamento de informação. A este fortalecimento dá-se o nome de Long Term Potentiation (LTP). A indução de LTP envolve numerosos recetores, nomeadamente a família dos recetores NMDA de glutamato. Durante fenómenos de estimulação, onde existe uma intensa despolarização da membrana do neurónio pós-sináptico, verifica-se um desbloqueio dos canais de cálcio destes recetores, que normalmente se encontram bloqueados pela presença de iões Mg2+. A abertura destes canais leva à entrada de Ca2+ para o interior do neurónio pós-sináptico, levando a um aumento da concentração intracelular deste mesmo ião, que leva à ativação das vias metabólicas da proteína cinase dependente de calmodulina II (CaMKII) e Proteína Cinase A (PKA) que têm um papel fundamental na potenciação da sinapse. A ativação da proteína CaMKII leva a alterações morfológicas menores, como o aumento das espinhas dendríticas e o aumento da condutividade dos recetores AMPA; por outro lado, a ativação da PKA leva à ativação dos fatores de transcrição CREB e ERK, que desencadeiam também alterações que potenciam a sinapse. Nos últimos anos vários grupos demonstraram que os astrócitos modulam a LTP através da libertação de gliotransmissores, nomeadamente o glutamato, a D-serina e o ATP. A libertação de ATP e a sua consequente metabolização a adenosina ao nível da fenda sináptica tem especial importância, uma vez que a adenosina extracelular formada exerce a sua acção sobre a transmissão sináptica. A adenosina actua através da ligação a quatro tipos diferentes de recetores acoplados a proteínas G: os recetores A1 e A3, que estão acoplados a subunidades Gi/o, levando a respostas inibitórias quando ativados; e recetores A2A e A2B, que estão acoplados a subunidades Gs, levando a respostas excitatórias quando ativados. O BDNF é uma neurotrofina com um papel neurofisiológico bastante importante por estar envolvido na regulação do desenvolvimento dos circuitos nervosos, na diferenciação e crescimento de axónios e dendrites, na formação e maturação de sinapses. Para além disso, o BDNF tem também um papel na regulação dos circuitos neuronais maduros e na regulação da LTP e long term depression (LTD), podendo potenciar a magnitude da LTP. O efeito facilitatório do BDNF sobre a magnitude da LTP acontece devido à ativação dos recetores TrkB, aos quais se liga com grande afinidade. A ativação dos recetores TrkB leva a alterações tanto a um nível pré-sináptico como pós-sináptico, que têm como consequência o aumento da excitabilidade do neurónio pós-sináptico. Existe também evidências de que este efeito potenciador do BDNF sobre a magnitude da LTP é dependente da ativação dos recetores A2A de adenosina. Uma vez que os astrócitos têm a capacidade de controlar a LTP por libertação de gliotransmissores, e adicionalmente o BDNF também modula a magnitude da LTP de um modo dependente da activação dos receptores A2A de adenosina, o objectivo do presente trabalho foi avaliar se o efeito do BDNF na LTP depende da libertação de gliotransmissores, nomeadamente ATP/adenosina. Para tal, foram realizados estudos electrofisiológicos, nomeadamente indução de LTP, utilizando fatias agudas de hipocampo obtidas a partir de ratinhos da estirpe dn-SNARE. Estes animais expressam um transgene (porção citosólica do domínio SNARE da sinaptobrevina 2) selectivamente em astrócitos, que pode ser manipulado, por administração de doxiciclina, de modo a bloquear ou ativar a gliotransmissão. Neste trabalho observou-se que um estimulo de indução de LTP θ-burst aumentou o declive dos fEPSP em 22±10% nos ratinhos WT (+DOX), e que nas mesmas fatias mas em presença de BDNF (20ng/ml), o mesmo paradigma de estimulação aumentou o declive dos fEPSP em 55±6.8% (p<0.05, n=5). O que corresponde a um efeito estatisticamente significativo do BDNF sobre a magnitude da LTP. Em ratinhos dn-SNARE (-DOX) a magnitude da LTP foi de 24±4% em condições controlo (sem BDNF) e de 29±3% em fatias tratadas com BDNF (p>0.05, n=4). Observou-te também que o efeito do BDNF é dependente da activação dos receptores de adenosina, uma vez que o efeito potenciador desta neurotrofina sobre a LTP foi perdido na presença do antagonista selectivo dos receptores A2A (SCH 58261) em animais dn-SNARE (+DOX). Estes resultados sugerem que a libertação de gliotransmissores pelos astrócitos controla o efeito potenciador do BDNF sobre a LTP. Uma vez que a activação dos receptores A2A da adenosina é fundamental para os efeitos mediados pelo BND na LTP, colocou-se a hipótese que os astrócitos seriam a possível fonte de adenosina envolvida da neste processo. Para testar esta hipótese fatias de hipocampo provenientes de ratinhos dn-SNARE (-DOX) foram perfundidas com o agonista selectivo dos receptores A2A de adenosina (CGS 21680 (30nM)), previamente ao tratamento com BDNF (20ng/ml). Na presença de CGS 21680 (30ng/ml), o estimulo θ-burst induziu um aumento do declive de 39±2%, e na presença de CGS 21680 (30ng/ml) e BDNF (20ng/ml) o declive dos fEPSP foi de 78±12% (p<0.05, n=3), o que corresponde a um efeito estatisticamente significativo do BDNF sobre a magnitude da LTP de 100% . Estes resultados mostram que os astrócitos têm um papel ativo na ação facilitadora do BDNF sobre a LTP e sugerem também que a principal fonte de adenosina envolvida no efeito do BDNF serão os astrócitos, através da sua libertação de ATP para a fenda sináptica e a posterior transformação deste ATP em adenosina. A adenosina assim formada leva à ativação de recetores A2A, permitindo a ação facilitadora do BDNF sobre a LTP. É importante de notar que outros gliotransmissores, nomeadamente o glutamato e a D-serina poderão ter também um papel ativo sobre esta ação do BDNF, juntamente com a adenosina. Assim sendo, o estudo do papel destes gliotransmissores sobre o mecanismo de potenciação da LTP pelo BDNF seria bastante interessante. Por outro lado, a replicação dos resultados obtidos neste trabalho usando um maior número de animais seria de elevado interesse, de modo a confirmar a viabilidade destes mesmos resultados.Astrocytes are one of the four types of glial cells that we can find in the Central Nervous System (CNS), with the remaining three being the microglia, oligodendrocytes and NG2 positive cells. Astrocytes are the type of nervous cell more abundant in brain, being responsible for numerous and complex functions that are essential for its correct functioning, through their role over the modulation synaptic transmission and neuronal excitability, as well as their role over the processing of information transmitted by neuronal circuits. These cells are also able of doing numerous functions of neuronal support, helping with the trophic support of neurons, in processes of neuronal survival and growth, in the process of neurite growth and in processes of the maintenance of synaptic efficiency. Besides this, these glial cells also contribute to the maintenance of the homeostasis of the brain, through their regulation of the concentrations of certain ions and neuroactive substances. Most of the astrocytes functions are executed through the release of neuroactive messengers, called gliotransmitters. The main Gliotransmitters are glutamate, adenosine triphosphate (ATP), D-serine, brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and also tumor necrosis factor alpha (TNF- α). The release of these molecules to the synaptic cleft and the interactions between these gliotransmitters and their receptors, localized both at a pre-synaptic and a post-synaptic level, lead to the modulation of the synaptic activity. The model that describes this mechanism of bidirectional communication between astrocytes and neurons is called the tripartite synapse model. This model describes that after the release of neurotransmitters by the pre-synaptic neuron to the synaptic cleft, these same neurotransmitters will bind not only to their receptors located on the post- synaptic neuron but also to their specific receptors present in the membrane of the astrocyte that encircles the synapse. Astrocytes possess numerous distinct types of receptors for the various neurotransmitters on their membrane, and because of this they can respond in different ways based on the kind of neurotransmitter that is released. The binding of these neurotransmitters to their receptors in the membrane of the astrocytes leads to an increase in the excitability if these cells due to an increase of the astrocytic intracellular calcium (Ca2+) concentration. This increase in Ca2+ concentration leads to the release of gliotransmitters to the synaptic cleft, which allows the modulation of the synaptic activity. Synapses possess plasticity that varies depending on their activity, which plays a role in the sculpting of synaptic connexions, especially during development. This plasticity, however, is also present in the adult brain, with the formation of memories being based around alterations of synaptic efficiency that strengthen the connexions between communicating neurons, which leads to the storage of information. To this strengthening we give the name Long Term Potentiation (LTP). The induction of LTP involves various receptors, namely the NMDA glutamate receptor family. During stimulation events, when there is an intense depolarization of the membrane of the post-synaptic neuron, it’s possible to observe the unblocking of the NMDA receptor calcium channels that are normally blocked by magnesium ions. The opening of these channels leads to the entry of Ca2+ ions into the post-synaptic neuron, which leads to an increase in the intracellular concentration of this same ion, which in turn culminates in the activation of the calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and Protein Kinase A (PKA) pathways that have a very important role in the potentiation of the synapse. The activation of CaMKII leads to morphological changes, like the increase in dendritic spines and the increase in the conductivity of AMPA receptors; on another hand, the activation of PKA leads to the activation of the ERK and CREB transcription factors, which also lead to changes that potentiate the synapse. An important aspect to take into account for this work is the fact that astrocytes can modulate LTP through their release of gliotransmitters, like glutamate, D-serine and ATP, in response to synaptic activity. The release of ATP and its consequent possible metabolization into adenosine in the synaptic cleft is of special importance, due to the fact that extracellular adenosine that is formed this way will be then capable of modulating synaptic transmission. Adenosine exerts its effect through its binding to four different types of receptors, which are coupled to G-proteins: A1 and A3 receptors, which are coupled to Gi/o subunits, leading to inhibitory responses when activated; and A2A and A2B receptors, that are coupled to Gs receptors, leading to excitatory responses when activated. BDNF is a neurotrophin that possesses a very important neurophysiologic role due to being involved in the regulation of the development of nervous circuits, in the differentiation and growth of axons and dendrites, in the formation and maturation of synapses. Besides that, BDNF also plays a role in the regulation of mature neuronal circuits and in the regulation of LTP and long-term depression (LTD), being capable of potentiating the magnitude of the invoked LTPs. The facilitating effect of BDNF over the magnitude of LTP is possible due to the activation of TrkB receptors, to which it binds with high affinity. The activation of TrkB receptors leads to changes at both a pre-synaptic and a post-synaptic level, and all of these changes lead to an increase in the excitability of the post-synaptic neuron, which explains the potentiating effect of BDNF over the magnitude of LTP. There is also evidence that this potentiating effect of BDNF over the magnitude of LTP is dependent of the activation of adenosine A2A receptors. Since astrocytes can control LTP through the release of gliotransmitters and, on the other hand, LTP can be enhanced by BDNF, the main aim of this work was to investigate the role of astrocytes upon the potentiation of hippocampal LTP by BDNF, and to identify gliotransmitters involved in this crosstalk between astrocytes, BDNF and LTP. fEPSP were recorded from the CA1 area of hippocampal slices prepared from WT and transgenic mice in which the SNARE-dependent release of gliotransmitters was selectively impaired in astrocytes (dn-SNARE). LTP was induced by theta-burst protocol in the Schaffer collaterals/CA1, by 3 trains separated by 200 ms, 3 pulses each, of 100Hz. In dn-SNARE mice the cytosolic portion of the SNARE domain of synaptobrevin 2 expression is suppressed by the presence of doxycycline (Dox) administration in their drinking water (25 μl/ml). The θ-burst stimulation increased the slope of fEPSP by 22±10% in WT (+DOX) mice, whereas in the same slices but in the presence of BDNF (20 ng/ml) the same induction paradigm enhanced fEPSP slope by 55±6.8% (p<0.05, n=5). In dn-SNARE (-DOX) mice the LTP magnitude was 24±4% in control condition (absence of BDNF (20ng/mL)) and 29±3% in slices superfused with BDNF (p>0.05, n=4). Since activation of adenosine A2A receptor is crucial for BDNF mediated effects on LTP, we hypothesised that astrocytes could be the source of adenosine involved in this processes. To test this hypotheses hippocampal slices from dn-SNARE (-DOX) mice were superfused with the selective A2AR agonist, CGS21680 (30nM), before the treatment with BDNF (20ng/ml). In the presence of CGS 21680 alone, θ-burst stimulation increased the slope of the fEPSP by 39±2%. In the presence of CGS 21680 and BDNF the LTP magnitude that was obtained was of 78±12% (p<0.05, n=3). This corresponds to a statistically significant effect of BDNF over LTP of 100%. The results obtained in this thesis show that astrocytes play an active role in the facilitating action of BDNF upon LTP, and suggest that they do so by being a source of the gliotransmitter adenosine and/or its precursor ATP, seeing as the facilitating action of BDNF over the magnitude of LTP is dependent on the activation of A2A receptors. It is important to note that other gliotransmitters, namely glutamate and D-serine might also have a role over this potentiating effect, together with adenosine, which makes them an interesting target for future studies of this particular mechanism. On another hand, the replication of the results obtained in this study with a larger amount of animals would also be of interest so as to increase the certainty of these findings.Vaz, Sandra Cristina Henriques, 1978-Repositório da Universidade de LisboaJesus, João Pedro de Almeida, 1993-2020-05-08T00:30:19Z20172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/33235TID:201700891enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:28:06Zoai:repositorio.ul.pt:10451/33235Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:48:22.495885Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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