Involvement of aquaporins in pancreatic cancer and melanoma: effect of metallodrugs on cell migration

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Coxixo, Ana Sofia Generoso
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/43190
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
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spelling Involvement of aquaporins in pancreatic cancer and melanoma: effect of metallodrugs on cell migrationAquaporinasMigração celularCancro do pâncreasMelanomaInibidoresTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019As aquaporinas (AQPs) são canais de membrana amplamente distribuídos em organismos vivos e geralmente preservados em mamíferos, incluindo roedores e humanos. Devido ao seu envolvimento em uma ampla gama de funções fisiológicas e doenças humanas, essas proteínas da membrana foram consideradas com grande potencial como alvos terapêuticos e descoberta de novos fármacos. A identificação e estudo de inibidores aquaporinas, canais proteicos de membrana altamente conservados permeáveis à água, glicerol, peróxido de hidrogénio e outros pequenos solutos como a ureia, desperta cada vez mais interesse. Os últimos anos foram muitos importantes para a compreensão dos diversos papéis das AQPs na saúde e na doença, particularmente, na capacidade das AQPs de permear não apenas água, mas também outras pequenas moléculas ou solutos, permitindo regular várias funções como volume celular, metabolismo energético, migração, adesão e proliferação. Até ao presente foram identificadas 13 isoformas de aquaporinas (AQP0-12) em mamíferos, distribuídas por todos os tecidos. Com base nas características funcionais e estruturais, as aquaporinas classificam-se em aquaporinas ortodoxas, estritamente envolvidas na permeabilidade à água (AQP0-2, AQP4, AQP5, AQP6 e AQP8) e aquagliceroporinas, facilitando o transporte de pequenos solutos não carregados como glicerol e ureia, adicionalmente à água (AQP3, AQP7, AQP9 e AQP10). As peroxiporinas (AQP1, AQP3, AQP5, AQP8 e AQP9) são uma subclasse de aquaporinas permeáveis ao peróxido de hidrogénio. Por fim, e devido à sua localização subcelular, as AQP11 e AQP12 são classificadas como S-aquaporinas, mostrando menor similaridade de sequência com as outras isoformas. A permeabilidade seletiva da AQP12 ainda não é certa. No entanto, existem indicações de que a AQP11 facilita o transporte de água e glicerol. Estudos clínicos e pré-clínicos mostram evidências de que a expressão de algumas AQPs aumenta em muitos tipos diferentes de cancro. De facto, devido ao seu papel importante no movimento transmembranar da água em resposta a gradientes osmóticos, bem como na captação de glicerol celular para síntese lipídica ou produção de ATP, as AQPs facilitam o crescimento do tumor, a infiltração local e as metástases, aumentando a migração celular, a angiogénese, a adesão da matriz celular e a interação com oncogenes. Estudos in vivo e in vitro mostraram oportunidades atraentes para a terapia direcionada para AQPs. O adenocarcinoma pancreático (PA) é uma doença agressiva que se desenvolve de maneira relativamente assintomática e que geralmente está avançada no momento do diagnóstico. Como é comum em tumores epiteliais, a carcinogénese desenvolve-se através da acumulação de mutações e lesões genéticas, levando à ativação de oncogenes e inativação de genes supressores de tumores. É necessário um entendimento completo dos mecanismos celulares e moleculares específicos do desenvolvimento e progressão do PA, a fim de identificar estratégias de deteção precoce, medidas preventivas e intervenções eficazes. O mau prognóstico do PA deve-se em parte à falta de informações fisiológicas sobre o desenvolvimento da doença. Linhas celulares estabelecidas continuam a ser uma ferramenta útil para investigar estes processos biológicos moleculares. O melanoma é um cancro que começa nos melanócitos. A maioria das células de melanoma ainda produz melanina, de modo que este tipo de tumores são, geralmente, castanhos ou pretos. Alguns melanomas não produzem melanina de modo que a lesão pode ser rosa, bege ou mesmo branca. Os melanomas podem desenvolver-se em qualquer parte da pele, no entanto, é mais provável o seu desenvolvimento no tronco (peito e costas) nos homens e nas pernas das mulheres. O pescoço e o rosto são outros locais comuns. A expressão elevada de AQP3 foi descrita em melanoma, e considerada como potencial alvo terapêutico. Estudos anteriores do nosso grupo, usando técnicas de imuno-histoquímica, mostraram que a AQP3 e a AQP5 são aberrantemente expressas em biópsias humanas de adenocarcinoma pancreático. Assim, neste trabalho investigámos o envolvimento de AQP3 e AQP5 na permeabilidade da membrana celular, proliferação celular e migração de células de adenocarcinoma pancreático humano (BxPC3) e melanoma humano (MNT-1), para validar seu potencial como biomarcadores e potenciais alvos terapêuticos. Para tal avaliámos a expressão de AQPs numa linha celular de adenocarcinoma pancreático e noutra de melanoma humano, assim como a permeabilidade da membrana à água e ao glicerol. Verificámos que a AQP3 é a isoforma mais abundantemente expressa em ambas as linhas celulares, enquanto que a AQP5 também está presente, mas em muito menor quantidade. As células BxPC3 apresentam maior valor de Pf do de que Pgly, tal como as células MNT-1, confirmando o papel preponderante da AQP3 (aquagliceroporina) o que já era espectável uma vez que ambas as aquaporinas presentes (AQP3 e AQP5) são permeáveis à água e apenas a AQP3 é aquagliceroporina, e apresenta permeabilidade ao glicerol. Estudos anteriores demonstram a difusão de peróxido de hidrogénio através da membrana, e por isso avaliou-se a influência do stress oxidativo nas células de adenocarcinoma pancreático (BxPC3). Conclui-se que, com diferentes tempos de incubação, o efeito do H2O2 não apresenta diferenças significativas na viabilidade celular até à concentração de 200mM. No entanto, a migração celular das mesmas células é afetada na presença do peróxido de hidrogénio, sofrendo uma redução de 50% após 12h de exposição. Posteriormente, foi avaliado o efeito citotóxico de compostos metálicos (ouro, vanádio e polioxometalatos) apontados como potenciais inibidores de aquaporinas e comparados com o efeito de compostos de ouro, reconhecidos como potentes inibidores da AQP3. Os compostos de ouro demonstraram afetar a viabilidade celular tanto em células pancreáticas como em células de melanoma humano, havendo uma redução de células viáveis para 50% ao fim de 24h de exposição aos mesmos. No ensaio de migração celular com estes compostos, esta também sofreu alterações. Ao fim de 24h, cerca de 40% da lesão das células controlo de adenocarcinoma pancreático continuava aberta enquanto a lesão do controlo fechou na totalidade. Nas células de melanoma humano observaram-se perturbações na velocidade de migração, no entanto, as células não perderam a capacidade de migrar com 5 µM de composto e ao fim de 24h estavam praticamente ao nível do controlo, com 100% da lesão fechada. Os compostos de vanádio, tal como os de ouro, afetaram a migração e viabilidade celular. Nas células pancreáticas a viabilidade celular, ao fim de 24h, ficou inferior a 50%, por outro lado, nas células de melanoma humano a viabilidade manteve-se acima do nível dos 50%. Estes factos corroboram com os resultados da migração celular, em que as células de melanoma conseguiram capacidade de migração para fechar a lesão tal como o controlo. Nas células pancreáticas, nem o controlo nem as células expostas aos compostos conseguiram fechar a lesão na totalidade. Os compostos de tungstato, não revelaram muito efeito na viabilidade celular até uma concentração de 20 µM, havendo sempre mais 50% das células viáveis. Na migração celular, tanto o POT-A como o POT-C, afetaram as células pancreáticas e de melanoma. Após 24h de exposição aos compostos, as células pancreáticas migraram cerca de 60% com o POT-A e 80% com o POT-C, comparativamente ao controlo. Já as de melanoma migraram cerca de 70% e 90%, na presença do POT-A e POT-C, respetivamente. Por último, avaliou-se o efeito dos compostos em estudo na permeabilidade das células pancreáticas e de melanoma humano. Nas células BxPC3, quando comparado com o controlo a permeabilidade é drasticamente reduzida, principalmente com o POT-A, ficando inferior a 20%. As células em junção com o Auphen, inibidor de AQP3 já anteriormente descrito, sofrem uma redução de permeabilidade de 100% para cerca de 20%. Já nas células de melanoma, na presença do Auphen, a permeabilidade é reduzida, mas mantêm-se acima dos 50%. Em suma, todos os compostos são promissores e merecem um estudo mais detalhado e pormenorizado. Deve-se ainda testar o efeito destes compostos noutros tipos de cancro.Aquaporins (AQPs) are membrane channels widely distributed in living organisms and generally preserved in mammals, including rodents and humans. Due to their involvement in a wide range of human physiological functions and diseases, these membrane proteins have been found to have great potential for pharmacological targeting and drug discovery. Clinical and preclinical studies show evidence that AQP expression increases in many different types of cancer. In fact, due to their important role in the transcellular movement of water in response to osmotic gradients, as well as cellular glycerol uptake for lipid synthesis or ATP production, AQPs facilitate tumor growth, local infiltration and metastasis, improving cell migration, angiogenesis, cell matrix adhesion and interaction with oncogenes. In vivo and in vitro studies have shown attractive opportunities for targeted therapy for AQPs. Pancreatic adenocarcinoma (PA) is one of the most aggressive diseases that develops without symptoms and is usually already in an advanced stage at the time of diagnosis. As is common in epithelial tumors, carcinogenesis develops through the accumulation of mutations and genetic lesions, leading to the activation of oncogenes and inactivation of tumor suppressor genes. In-depth knowledge of the specific cellular and molecular mechanisms of PA development and progression is needed to identify early detection strategies, preventive measures and effective interventions. The poor prognosis of this disease is essentially due to the lack of molecular information on the development of the disease. Established cell lines remain a useful tool for investigating these molecular events. Melanoma is a type of cancer that begins in melanocytes, also called malignant melanoma or cutaneous melanoma. Most affected cells still produce melanin, so melanoma tumors are usually brown or black. But some melanomas do not produce melanin and can be pink, beige or even white. Melanomas can develop anywhere on the skin of the human body, but they are more likely to start on the trunk (chest and back) in men and on the legs of women. The neck and face are also very common places. Previous studies by our research group using immunohistochemical techniques have shown that AQP3 and AQP5 are aberrantly expressed in human tissues of pancreatic adenocarcinoma. Throughout this project, we aim to investigate the involvement of AQP3 and AQP5 in cell membrane permeability, cell proliferation and migration of human pancreatic adenocarcinoma (BxPC3) and human melanoma (MNT-1) cells, to validate their potential as biomarkers and potential targets We evaluated the expression of AQPs in a pancreatic adenocarcinoma cell line and in another human melanoma cell, as well as the membrane's permeability to water and glycerol. We found that AQP3 is the most abundantly expressed isoform in both cell lines. BxPC3 cells have a higher Pf value than Pgly, as do MNT-1 cells, confirming the predominant role of AQP3 (aquaglyceroporin), which was already expected since both aquaporins present (AQP3 and AQP5) are permeable to water and only AQP3 is an aquaglyceroporin, being permeable to glycerol. Previous studies have demonstrated the diffusion of hydrogen peroxide across the membrane, and therefore the influence of oxidative stress on BxPC3 has been assessed. It is concluded that, with different incubation times, the effect of H2O2 does not present significant differences in cell viability. However, cell migration of the same cells is affected in the presence of hydrogen peroxide, which is reduced. The effect of selected metallodrugs (potential inhibitors of aquaporins) on the viability and migration of cancer cells was determined in pancreatic cell lines and compared with the same effect in melanoma, to determine their selectivity and evaluate their potential for therapy of AQP-dependent pancreatic cancer. Of all those testes, the tugstate compounds showed the best results. Finally, the effect of the compounds under study on the permeability of pancreatic cells and human melanoma was evaluated. In BxPC3 cells, when compared to the control, the permeability is drastically reduced, mainly with POT-A, being below 20%. We have identified new potential aquaporin modulators, which may prove to be therapeutic compounds. The presence of POT-A and POT-C leads to reductions in permeability, migration and cell viability. When compared to Auphen, it reveals better results. However, further studies are needed.Rodrigues, Maria da Graça Tavares Rebelo de SoveralRepositório da Universidade de LisboaCoxixo, Ana Sofia Generoso2022-12-09T01:31:54Z2019-12-092019-11-222019-12-09T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43190TID:202435300enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:42:56Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43190Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:55:45.333033Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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