Ultrasound assisted oncolytic virotherapy: in vitro and in vivo studies
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|---|---|
| Data de Publicação: | 2015 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/22381 |
Resumo: | Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015 |
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Ultrasound assisted oncolytic virotherapy: in vitro and in vivo studiesSonoporaçãoViroterapiaVírus oncolíticosCavitação acústicaUltrassons focalizadosIsolated limb perfusionBN175Ratos Brown NorwegianTeses de mestrado - 2015Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Biotecnologia MédicaTese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A ‘sonoporação’ é um processo através do qual a permeabilidade de membranas celulares é modificada. Esta alteração na membrana leva à formação de poros através dos quais pequenas moléculas conseguem passar. Nas últimas décadas, investigação na área de viroterapia mediada por ultrassons focalizados, na presença de agentes de contraste, designados por ‘micro bolhas’, provou que este tratamento poderia ser uma boa alternativa para o tratamento de tumores. As terapias em estudo incluem estratégias tais como o recurso a vírus oncolíticos que têm afinidade para tecidos inflamados e que por activação do sistema imunitário causam a sua destruição – estes vírus são conhecidos em viroterapia como ‘vírus suicidas’. Aplicações com vírus oncolíticos encontram no processo de sonoporação uma forma de aumentar/facilitar a entrada de conteúdo viral para o interior das células cancerígenas mas existem ainda muitos problemas a ultrapassar em termos de eficiência e segurança para que estes tratamentos possam ser utilizados em meio clínico. A toxicidade da ‘terapia viral’ é um dos maiores problemas associados e com o intuito de minimizar este problema, foi desenvolvida uma nova técnica designada por ‘Isolated Limb Perfusion’ (ILP). Esta técnica tem por base o isolamento de vasos sanguíneos que irrigam a região do tumor, normalmente aplicada nos membros superiores ou inferiores, isolando o membro da circulação sistémica através de um torniquete. A técnica ILP vai ser usada neste projecto em ratos da linhagem Brown Norwegian, nos quais serão implantadas células cancerígenas (linha de células de fibrosarcoma BN175) nos membros inferiores. Um fibrosarcoma/sarcoma é um tumor maligno dos tecidos moles que normalmente se desenvolve nos membros inferiores. Os tratamentos para este tipo de cancro incluem uma cirurgia extremamente invasiva com possibilidade de remoção do membro para garantir a sobrevivência do doente e que é normalmente combinada com radioterapia. Posto isto, é muito importante que se promova a investigação neste tipo de terapias de forma a tornar os tratamentos menos invasivos. Com este objectivo, este projecto é um estudo piloto com fundamento num estudo de Pencavel et al., com o título “Isolated limb perfusion with melphalan, tumour necrosis factor-alpha and oncolytic vaccinia virus improves tumour targeting and prolongs survival in a rat model of advanced extremity sarcoma”, publicado em 2015 em International Journal of Cancer. Assim, o propósito deste estudo é adicionar ‘ultrassons focalizados’ a esta terapia combinada para verificar se i) há um aumento da entrada e replicação do vírus de forma a aumentar a eficiência do tratamento e ii) se existe a possibilidade de evitar o uso de um factor de necrose tumoral (TNF-α) para reduzir a toxicidade do tratamento. Este factor, pertence a um grupo de citocinas capaz de provocar a morte de células tumorais e que possuem uma vasta gama de acções pró-inflamatórias sendo altamente tóxico quando em circulação sistémica. A distribuição de vírus mediada por ultrassons oferece uma oportunidade para a realização de terapia direccionada não-invasiva em órgãos internos específicos. Para isto, a sonoporação envolve o uso de micro bolhas que são injectadas na corrente sanguínea em conjunto com os restantes agentes químicos e os vírus. Quando estas micro bolhas são expostas aos feixes de ultrassons focalizados, a uma dada frequência, estas expandem-se e contraem com rapidez. Se as micro bolhas estiverem próximas de uma membrana celular, a sua deformação ou fragmentação física aumenta a porosidade da membrana celular. O mecanismo exacto envolvido ainda não é completamente compreendido, mas é associado a cavitação acústica que pode ser estável ou instável. A cavitação estável ocorre quando as bolhas oscilam por sucessivas compressões e descompressões mas permanecem intactas. Por outro lado, a cavitação instável ocorre quando são usadas amplitudes de alta pressão, conduzindo ao colapso das bolhas. Os principais objectivos deste projecto piloto são estudar a distribuição do vírus nos tumores e quantificar o número de partículas virais com capacidade de se replicarem. Isto é conseguido através de ensaios químicos como qPCR (quantitative real-time Polymerase Chain Reaction), Plaque Assay (para quantificar a presença de vírus) e Imunofluorescência. Este processo vai incluir experiências in vitro com a linha de células BN175, inicialmente para testar o efeito da utilização de (i) ultrassons focalizados (ii) micro bolhas e (iii) ultrassons focalizados e micro bolhas. As experiências in vitro vão incluir o estudo do efeito de diferentes parâmetros físicos tais como: o valor de pressão in situ causado pela propagação da onda de som; a quantidade de tempo em que os ultrassons são emitidos durante um determinado tempo de exposição (Duty Cycle); a frequência de repetição do pulso de ultrassom; o tempo de exposição e a concentração de micro bolhas na solução a ser testada. O objectivo da variação destes parâmetros, que é feita com base na literatura, tem como objectivo promover a cavitação instável e ao mesmo tempo evitar que isto cause a morte das células cancerígenas para garantir que os vírus poderão vir a atravessar a membrana de células viáveis. A partir dos resultados encontrados através das experiências in vitro, serão escolhidos os melhores parâmetros a utilizar in vivo para determinar se uma terapia que combina ultrassons focalizados, Melphalan, TNF-α e Vírus da Varíola (geneticamente modicado para uma ‘versão’ menos infecciosa) será uma potencial forma de tratamento/cura de tumores, de forma menos invasiva. Para realizar as experiências in vitro, foi realizada uma calibração dos equipamentos a utilizar, nomeadamente dos transdutores, para garantir que todos os ‘outputs’ são conhecidos (com uma incerteza de 10% associada). Além disto, foi realizado um estudo para perceber quais são os valores de pressão que favorecem a cavitação inercial para poder associar os resultados à presença ou ausência de cavitação inercial, de acordo com os parâmetros utilizados. Os testes in vitro mostraram que valores de pressão superiores a 0.9 MPa, para valores fixos de frequência de repetição do pulso de 100 Hz, um feixe com 40 ciclos e uma exposição de 0.5 s, reduzem a viabilidade das células em cerca de 80%. A variação dos restantes parâmetros parece não ter muita influência a nível da viabilidade celular. Os resultados in vivo não permitem concluir acerca do aumento da eficiência do tratamento pois os níveis de pressão in situ utilizados parecem ser nocivos ou para as partículas virais ou para as células – mais experiências serão necessárias para tirar conclusões in vivo.The phenomenon by which ultrasound may transiently alter the structure of the cellular membrane, and thus allowing enhanced uptake of low and high molecular weight molecules into the cell is defined as Sonoporation. In gene therapy, the main goal is to increase the delivery efficiency of exogenous nucleic acid to a site-specific target. For gene transfer using sonoporation, the biophysical effects involved include cavitation, radiation pressure, and microstreaming - the shear forces present near the microbubbles. The acoustic pressures required to destroy microbubbles lie in the diagnostic range, and if these are too high or last too long, undesirable levels of cell killing will occur, resulting in poor DNA transfer. There is the need to develop a new treatment for a soft tissue tumor defined as fibrosarcoma which is a malignant tumor that usually develops in the legs and whose treatment involves a wide excision, usually combined with radiation therapy. This project is a pilot study in which Focused Ultrasound and Microbubbles is added to a combined therapy including Melphalan, TNF-α and Vaccinia Virus to try to enhance the efficacy and reduce the toxicity of the treatment. The main goals of this pilot project are to study tumor virus distribution and then to quantify the number of viral particles in the tumors using appropriate assays (e.g. qPCR, Plaque Assay, Immunofluorescence). This involves in vitro experiments with BN175 rat sarcoma line, initially to test a combination therapy with the virus in the presence or absence of (i) focused ultrasound (ii) microbubble and (iii) focused ultrasound and microbubbles. The physical parameters to be optimised are peak rarefactional focal pressures, duty cycle, pulse repetition frequency, exposure duration and microbubble concentration. In vitro results suggest that once inertial cavitation starts, the viability of BN175 cells decreases and this effect is higher in the presence of microbubbles. In vivo experiments in Brown Norwegian rats should help to determine the effectiveness of the combined therapy using Focused Ultrasound in the presence of Microbubbles, Melphalan, TNF-α and Vaccinia Virus using the technique of Isolated Limb Perfusion but the results suggest that the use of Focused Ultrasound and Microbubbles might be killing the virus. Although, the results from qPCR analysis and viral plaque assays are not enough to confirm this theory and the histochemical analysis failed.Haar, Gail TerConceição, RaquelRepositório da Universidade de LisboaVilhena, Nádia Andreia Pacheco2016-01-21T15:17:11Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22381TID:201069008enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:30Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22381Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:39:58.688257Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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