Nova abordagem para deteção das subespécies de Photobacterium damselae

• Autor(a) principal: Mascarenhas, Soraia Andreia Coelho
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/12793
• topic: Biotecnologia ambiental; Aquacultura; Bactérias patogénicas; Electroforese em gel

Em todo o mundo, os recursos para pesca encontram-se próximos dos limites de exploração sustentável. A prática de aquacultura é uma atividade que veio ajudar a contornar o esgotamento dos recursos pesqueiros, sendo hoje em dia responsável por contribuir com cerca de metade do fornecimento de peixe para consumo humano mundial. No entanto, a aquacultura é propícia ao aparecimento de surtos de doenças causadas por agentes patogénicos bacterianos. Estes geralmente têm um impacto nefasto nos sistemas de cultivo causando muitas vezes elevadas taxas de mortalidade e consequentes perdas económicas. Photobacterium damselae subsp. damselae e Photobacterium damselae subsp. piscicida, são dois agentes patogénicos a que iremos dar especial atenção neste trabalho, uma vez que são responsáveis por provocar elevadas taxas de mortalidade em sistemas de aquacultura. Estas são caracterizadas por evidenciar uma difícil distinção entre si, apesar de apresentarem diferenças fenotípicas marcantes. Hoje em dia, recorre-se a inúmeras técnicas moleculares para o diagnóstico de doenças em aquacultura, pelo que, o objetivo do presente estudo foi avaliar a utilização dessas técnicas para deteção das duas subespécies de P. damselae, através da utilização do gene ToxR como marcador filogenético. Para o efeito, inicialmente testou-se a utilização da técnica de amplificação molecular LAMP (Loop mediated isothermal amplification), caracterizada como sendo uma técnica isotérmica inovadora, de baixo custo e que apresenta elevada sensibilidade e especificidade. No entanto, ao longo deste estudo, não foram obtidos resultados de amplificação positivos, o que conduziu a uma mudança de abordagem. A deteção das duas subespécies em estudo só foi possível através da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), sendo a análise e visualização dos fragmentos amplificados realizada através das técnicas de eletroforese em gel de agarose e eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE). Os primers utilizados amplificaram fragmentos com cerca de 300 pb e a análise dos fragmentos obtidos por DGGE revelou que foi possível a distinção das duas subespécies. Foi também possível a sua deteção e distinção em amostras ambientais reais provenientes de sistemas de aquacultura.