Relevance of NLRP3 inflammasome in A1 astrocytes: impact of Aβ-induced toxicity
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| Data de Publicação: | 2020 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/47735 |
Resumo: | Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021 |
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Relevance of NLRP3 inflammasome in A1 astrocytes: impact of Aβ-induced toxicityDoença de AlzheimerNeuroinflamaçãoInflamassoma NLRP3PiroptoseAstrócitosTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021A doença de Alzheimer tem sido reconhecida como a doença neurodegenerativa mais prevalente na população idosa, ainda sem uma cura ou um tratamento eficaz, pelo que se torna de extrema importância mobilizar recursos para que o conhecimento e a procura de tratamento para esta doença evoluam. Aquela que se acredita ser a principal causa da patologia é a acumulação extracelular do péptido β-amiloide (Aβ) que acaba por se aglomerar em placas e causar danos neuronais. Esta doença, tal como outras doenças neurodegenerativas, tem vindo a ser associada à neuroinflamação, uma resposta comum do sistema imune que, quando exacerbada, provoca danos no tecido e morte neuronal. No sistema nervoso central, esta resposta é maioritariamente atribuída à microglia e aos astrócitos, as células imunes do cérebro, que expressam os mediadores da inflamação: os inflamassomas. Existe um, em particular, que tem sido cada vez mais bem caracterizado e evidenciado como tendo um papel importante na progressão da doença: o inflamassoma NLRP3. Este complexo é composto por uma proteína sensorial (domínio NLRP3), uma proteína de ligação (ASC) e uma proteína efetora (Caspase-1). O inflamassoma NLRP3, quando ativo, é responsável pela clivagem da pro-caspase-1 em Caspase-1 que, por sua vez, cliva as citocinas pró-inflamatórias, pró-IL-1β e pró-IL-18, nas suas formas ativas: IL-1β e IL-18. A ação do péptido Aβ no NLRP3 tem vindo a ser investigada e, em pacientes de Alzheimer encontraram-se elevados níveis de IL-1β no líquido cefalorraquidiano, assim como de NLRP3 e Caspase-1 no tecido nervoso. Assim sendo, parece que a compreensão da ação deste inflamassoma e a sua inibição poderão ser potenciais alvos terapêuticos para esta patologia. Apesar da ação do NLRP3, associada ao péptido Aβ, ser maioritariamente atribuída à microglia, os astrócitos são um tipo celular bastante importante no cérebro que também expressam o inflamassoma. Assim, é plausível assumir que estas células podem contribuir para a resposta inflamatória observada na doença de Alzheimer, através do NLRP3. Os astrócitos, tal como a microglia apresentam dois fenótipos principais: A1 e A2. Os astrócitos A1, são nocivos para os neurónios e expressam em abundância o componente 3 do complemento (C3) que se tem revelado um marcador promissor destas células. Para além disso, são principalmente ativados por estímulos inflamatórios e estão relacionados com a microglia M1, uma vez que fatores libertados por esta (IL-1α, TNF-α and C1q) mostraram induzir este fenótipo nos astrócitos. O objetivo deste trabalho é compreender se o péptido Aβ sozinho é capaz de induzir o fenótipo A1 nos astrócitos e de promover a formação e ativação do inflamassoma NLRP3 nestas células; ou se apenas após uma conversão para A1 pela microglia, conseguem responder eficientemente ao péptido Aβ via NLRP3. Para isto, este projeto utilizou culturas puras de astrócitos preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley com 2-3 dias de vida. A microglia contaminante foi eliminada pela combinação do método de agitação e do tratamento com clodronato. As culturas foram estimuladas com o péptido Aβ25-35 (condição Aβ25-35), com os fatores derivados da microglia previamente mencionados (condição F) ou com ambos (condição F/Aβ25-35) e usadas como um modelo para estudar a ativação do NLRP3 nos astrócitos, num contexto de toxicidade induzida por Aβ. Numa segunda fase do projeto, as culturas foram tratadas com o inibidor específico do NLRP3, MCC950, previamente aos insultos anteriormente referidos. A reatividade dos astrócitos, e a expressão dos componentes do inflamassoma (proteínas NLRP3, ASC e Caspase-1) foram analisados por Western Blotting (WB) e imunocitoquímica, enquanto a secreção de IL-1β foi avaliada por ELISA. Numa primeira análise, através de WB, os resultados demonstraram que o péptido Aβ25-35 promoveu um aumento na expressão do C3 quase tão eficientemente como os fatores derivados da microglia e também promoveu o início da clivagem desta proteína, refletido na formação do fragmento iC3b que participa, entre outras, na fagocitose. A reatividade dos astrócitos também foi avaliada pela expressão da proteína GFAP que demonstrou ser extremamente heterogénea entre experiências, comprovando a tendência que tem vindo a surgir de que esta não é um bom marcador de reatividade dos astrócitos. Por imunocitoquímica foi possível observar que a proteína C3 marcou principalmente o núcleo, que sugere um papel desta proteína na regulação da transcrição génica, papel este que também já foi sugerido noutras células. Em relação à expressão dos componentes do inflamassoma, por WB foi possível observar que os astrócitos expressam todos os componentes do complexo e que, em particular, o domínio NLRP3 e a Caspase-1 ativa são significativamente aumentados pelas condições Aβ25-35 e F o que se revelou surpreendente porque, apesar do péptido Aβ ser descrito como um ativador do complexo, os fatores derivados da microglia são maioritariamente descritos como estímulos de priming, promovendo o aumento da transcrição do domínio NLRP3, mas sem ativação da Caspase-1. Surge, assim a hipótese de que algo neste sistema poderá estar a induzir a ativação do inflamassoma. De facto, a anafilotoxina C3a, derivada da clivagem do C3, já foi sugerida como ativadora do complexo e poderá estar a ser o estímulo ativador nesta condição. Por imunocitoquímica foi possível observar que todos os componentes do inflamassoma co-localizaram com a marcação de GFAP, corroborando os resultados previamente obtidos por WB de que os astrócitos realmente expressam estes componentes. Para além disso, os componentes do complexo localizaram-se maioritariamente na zona perinuclear e não só se co-localizaram com o GFAP como se co-localizaram entre si, sugerindo a junção dos diferentes domínios para formar o inflamassoma. A produção de IL-1β pelas células foi avaliada por ELISA e, apesar de terem sido as condições Aβ25- 35 e F que anteriormente demonstraram maior expressão dos componentes que constituem o NLRP3, foi a condição F/Aβ25-35 que apresentou um aumento significativo na secreção de IL-1β para o meio. A condição Aβ25-35 também demonstrou uma tendência de aumento, mas na condição F a secreção de IL 1β manteve-se praticamente idêntica ao controlo. Há várias hipóteses que podem explicar estes resultados, nomeadamente a produção de IL-1β na condição F/Aβ25-35 não estar a acontecer via NLRP3 ou a ocorrência de um mecanismo repressivo nas condições Aβ25-35 e F que impede a libertação da IL 1β para o meio extracelular, mecanismo esse inexistente na condição F/Aβ25-35. A primeira hipótese é descartada quando as células são tratadas com o MCC950. Neste caso, observou-se uma diminuição drástica na produção e IL-1β, em todas as condições incluindo o controlo, mas principalmente na condição F/Aβ25-35, o que constitui uma forte evidência de que os astrócitos expressam um inflamassoma NLRP3 funcional. Por fim, foi avaliada a clivagem da GSDMD (GSDMD-NT), a proteína com capacidade de formação de poros nas membranas celulares conduzindo à piroptose, um tipo de morte celular inflamatória. A GSDMD é clivada pela Caspase-1 ativa e, portanto, é dependente do NLRP3. Neste modelo observou se uma tendência de aumento da GSDMD-NT na condição F e na condição Aβ25-35, o que vai de encontro à maior expressão da Caspase-1 ativa encontrada nestas condições. No entanto, a amostra analisada foi pequena e mais experiências são necessárias para se atingir significância estatística. Tendo em conta todas os resultados deste trabalho, podemos concluir que os astrócitos A1 são capazes de contribuir para a neuroinflamação observada na doença de Alzheimer, via NLRP3. Estas células, não só respondem ao insulto do péptido Aβ, como um contacto próximo com a microglia, nomeadamente com os fatores por si secretados, potenciam esta resposta. Para além disso, os próprios astrócitos A1 parecem ser susceptíveis ao efeito deste complexo, através de morte celular por piroptose, comprometendo assim a homeostasia do sistema nervoso.Alzheimer’s Disease (AD) is associated with neuroinflammation, an immune response in the brain performed by microglia and astrocytes. The best characterized mediator of inflammation is the NLRP3 inflammasome, and its activation by danger molecules leads to the release of Interleukin-1β (IL-1β). Astrocytes present one phenotype, characterized by increased expression in C3 protein (A1 phenotype), when exposed to Aβ, the main cause of AD. NLRP3 assembly and activation is not yet fully understood in astrocytes in a context of Aβ-induced toxicity, neither is the potentiation of C3 expression by Aβ. The present study aims to investigate the induction of the A1 phenotype in astrocytes, and the NLRP3 expression and assembly in these cells in a model of Aβ-induced toxicity. The impact of microglia-derived factors in these events will also be addressed. Primary cultures of astrocytes were prepared and contaminating microglia were eliminated by overnight shaking and treatment with clodronate (100 µg/ml). Cells were stimulated with Aβ25-35 (25 µM) and with microglia-derived factors (IL-1α (3 ng/ml), TNF- α (30 ng/ml) and C1q (400 ng/ml)) (F) both individually and concomitantly for 24h. In a second group of experiments, cells were treated with MCC950 (1μM), 1h before the insults. Both F and Aβ25-35 promoted the increase in C3 expression and C3 was shown to be localized in the nucleus, suggesting a role for gene transcription. NLRP3 components, namely NLRP3 and Caspase-1, were upregulated especially in astrocytes under F and Aβ25-35 stimulation, but IL-1β production was higher when cells were co-incubated with both. GSDMD cleavage showed an apparent upregulation in F and Aβ25-35 condition. Altogether, these data suggest an important role of A1 astrocytes in the neuroinflammatory response towards Aβ peptide, via NLRP3 activation. These results will be relevant for AD, since exacerbation of inflammatory responses is known to promote the pathogenesis of the disease.Valente, ClaúdiaGomes, Cláudio M.Repositório da Universidade de LisboaCampos, Mariana Fernandes Van Zeller da Silva2022-12-30T01:31:01Z202120202021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/47735TID:202693414enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:50:52Zoai:repositorio.ul.pt:10451/47735Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:44.160436Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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