Genetic requirements for Piwi-induced stable transgenerational gene silencing in Caenorhabditis elegans
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| Data de Publicação: | 2012 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/7404 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 |
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Genetic requirements for Piwi-induced stable transgenerational gene silencing in Caenorhabditis elegansBiologia molecularSilenciamento de genesExpressão génicaTeses de mestrado - 2012Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012A descoberta, em 1998, da interferência por RNA (RNAi) revelou que pequenos RNAs não codificantes estão envolvidos no controlo da expressão genética. Atualmente, várias vias de RNAi são conhecidas em Eucariotas. Apesar de divergirem em muitos aspetos, todas possuem complexos regulatórios envolvendo uma proteína Argonauta e um pequeno RNA. O complexo Argonauta-pequeno RNA vai ligar-se a RNAs mensageiros (mRNAs) com sequência complementar. De seguida, a expressão do mRNA alvo será afetada, nomeadamente, o mRNA poderá ser degradado ou poderá ocorrer inibição da sua tradução. O silenciamento genético promovido pelas vias de RNAi pode também dar-se ao nível da cromatina. Nesse caso, há o recrutamento de complexos enzimáticos capazes de modificá-la. Assim, utilizando estas plataformas mecanísticas, as vias de RNAi regulam a expressão genética a vários níveis, tendo particular importância no controlo de elementos genéticos considerados egoístas ou parasíticos, como os elementos transponíveis (TEs). As proteínas Argonautas podem ser divididas em três subfamílias: a subfamília Ago, cujos membros são expressos ubiquamente e associam-se a RNAs em cadeia dupla; a subfamília Piwi, que são expressas na linha germinal dos metazoários e associam-se a um tipo específico de pequenos RNAs de cadeia simples, os piRNAs; e a subfamília Wago, cujos componentes estão apenas presentes em Nemátodes, tal como Caenorhabditis elegans. Em C. elegans, existem cinco classes de pequenos RNAs, divididas de acordo com a sua dimensão, alterações químicas e Argonautas às quais se associam: pequenos RNAs primários, 22G-RNAs, 21U-RNAs, 26G-RNAs e microRNAs. Os pequenos RNAs primários são RNAs de cadeia dupla que, uma vez dentro das células do nemátode, são clivados em pequenos RNAs. Posteriormente, estes irão associar-se a uma Argonauta que removerá uma das cadeias e o complexo pequeno RNA-Argonauta ligar-se-á a um mRNA alvo. Estes pequenos RNAs primários, não justificam, por si, o silenciamento genético robusto que é observado. Para um forte silenciamento, é necessário que haja amplificação do sinal. Para este efeito, são recrutadas para o mRNA alvo RNA Polimerases dependentes de RNA (RdRPs) que sintetizam pequenos RNAs secundários. Estes são denominados 22G-RNAs por exibirem um comprimento de 22 nucleótidos e uma forte tendência para guanosina na sua extremidade 5’. Por sua vez, os 22G-RNAs vão associar-se a Argonautas da classe Wago, exercendo silenciamento genético de formas que ainda não são completamente claras. Recentemente, foi descoberta em C. elegans uma Argonauta expressa nas células somáticas, denominada NRDE-3, que após a ligação a 22G-RNAs, migra para o núcleo e interage com pré-mRNAs com sequência complementar ao 22G-RNA que transportam. Após o reconhecimento de um pré-mRNA complementar, a NRDE-3 recruta os fatores nucleares NRDE-1, NRDE-2 e NRDE-4 que, por sua vez, irão inibir a progressão da Polimerase de RNA II e recrutar enzimas ou complexos enzimáticos modificadores de cromatina, como as metiltransferases de histonas. Estas depositarão marcas na cromatina dos genes alvo, provocando silenciamento genético. Um exemplo concreto é a trimetilação no nono resíduo de lisina da cauda da histona H3 (H3K9me3). Em Eucariotas, as proteínas Piwi, associadas a piRNAs, mantêm TEs silenciados, sendo fulcrais para a manutenção da linha germinal. Os 21U-RNAs de C. elegans, assim denominados por terem 21 nucleótidos de comprimento e uma forte propensão para uracilo na sua extremidade 5’, foram recentemente identificados como piRNAs, pois associam-se às proteínas Piwi, dependendo delas para a sua síntese na linha germinal. C. elegans tem duas proteínas Piwi, PRG-1 e PRG-2 que são expressas na linha germinal. É de notar que PRG-1 é preponderante para a atividade dos 21U-RNAs, enquanto PRG-2 não aparenta ser tão relevante. Os 21U-RNAs são transcritos principalmente de duas vastas regiões localizadas no cromossoma IV. Curiosamente, os 21U-RNAs diferem de piRNAs de outros sistemas por serem transcritos como unidades individuais, graças a um motivo conservado, localizado a montante do 21U-RNA, que é reconhecido por fatores de transcrição da família Forkhead. Após a transcrição de dado 21U-RNA, este é processado de uma forma que não é completamente clara, mas que inclui metilação a 3’. Seguidamente, os 21U-RNAs vão associar-se à PRG-1 e juntos vão ligar-se a mRNAs alvo que poderão ser transcritos de TEs ou de outros genes que codifiquem para proteínas expressas na linha germinal. Esta ligação não exige perfeita complementaridade de bases, tolerando algumas bases desemparelhadas. O complexo PRG-1- 21U-RNA conduz ao recrutamento de RdRPs o que, pela produção de 22G-RNAs e a sua associação a WAGOs, irá reforçar o silenciamento genético. Esta via silencia, de forma robusta, TEs na linha germinal. Presumivelmente, outros genes importantes para a gametogénese também poderão ser regulados pelos 21U-RNAs. Em C. elegans, o silenciamento genético induzido por RNAi pode ser herdado. No entanto, o silenciamento acaba por diluir-se após um número muito curto de gerações. A base mecanística e os fatores envolvidos eram, até há pouco tempo, desconhecidos. Estudos recentes identificaram os 22G-RNAs e a marca de cromatina H3K9me3 na base de silenciamento genético hereditário. Tanto as proteínas NRDE como as WAGO foram diretamente implicadas. No entanto, a indução de silenciamento genético transgeneracional nunca foi atribuída a piRNAs. A caracterização de um novo tipo de silenciamento genético induzido por pequenos RNAs, em particular por piRNAs, que tenha capacidade de ser mantido por um número indefinido de gerações, foi o foco do trabalho experimental apresentado nesta dissertação. Este silenciamento foi originalmente encontrado em estirpes portadoras de transgenes em cópia única no genoma, com expressão específica na linha germinal. Estes transgenes foram silenciados espontaneamente e o silenciamento foi transmitido de forma estável e totalmente penetrante à sua descendência. Pelo papel dos 21U-RNAs no seu estabelecimento, este silenciamento genético foi denominado de silenciamento epigenético induzido por RNAi (RNAe). Uma vez estabelecido, o RNAe torna-se independente de PRG-1 e perpetua-se indefinidamente sem sinais de reversão. Os objetivos desta dissertação almejavam a identificação de genes envolvidos na manutenção deste novo paradigma de silenciamento genético, que ocorre na linha germinal de C. elegans. Para tal, recorri a cruzamentos genéticos, cruzando estirpes portadoras do transgene silenciado por RNAe com estirpes mutantes para um gene candidato. Através deste sistema experimental, a reativação do transgene indica que o gene candidato está envolvido na manutenção do RNAe. Os meus resultados apoiam o envolvimento de 22G-RNAs na manutenção do RNAe, uma vez que uma mutação no gene mut-7, codificante para uma exonuclease putativa e que foi previamente implicado na biogénese de 22G-RNAs, anula o RNAe. As WAGOs foram também implicadas, uma vez que wago-9 mutado reativa o transgene. Recentemente, outros demonstraram que WAGO-9 está presente no núcleo e poderá atuar na linha germinal de forma análoga a NRDE-3. A via NRDE de RNAi nuclear foi também implicada, uma vez que mutantes de nrde-1 e nrde-2 não apresentam RNAe. Um efeito materno foi igualmente notado, dado que a reativação do transgene foi consistentemente observada na segunda geração de homozigotia para o gene candidato. Além disso, um mutante defetivo para RNAe foi recuperado após triagens de mutantes. Este mutante apresentou sensibilidade a RNAs em cadeia dupla exógenos, indicando que o mutante não faz parte da classe RNAi defetivo (Rde). Tomados em conjunto, estes resultados apoiam um modelo em que, após o estabelecimento do RNAe, há produção de 22G-RNAs que se poderão ligar a WAGO-9 e juntos migrarão para o núcleo. No núcleo, o complexo 22G-RNA - WAGO-9 irá recrutar as proteínas NRDE1, NRDE-2 e NRDE-4, que por sua vez poderão recrutar complexos enzimáticos modificadores de cromatina, depositando H3K9me3. Para o restabelecimento de RNAe a cada geração, provavelmente ocorrerá deposição materna de 22G-RNAs nos embriões. Por sua vez, estes pequenos RNAs herdados irão provavelmente restabelecer as marcas na cromatina. Mais, os 22G-RNAs presumivelmente serão sintetizados de novo a cada geração. Os resultados aqui apresentados elucidam quais as vias e genes necessários para o RNAe, um novo fenómeno de regulação estável e duradoura da expressão genética. Estes estudos contribuem para a compreensão da regulação da expressão genética por pequenos RNAs. A um nível mais amplo, o RNAe poderá ter implicações na compreensão de fenómenos evolutivos e do desenvolvimento.In metazoans RNAi regulates gene expression and has great importance in the most diverse biological processes. The spreading of RNAi-induced gene silencing through multiple generations has been described. However such gene silencing events are transient, eventually disappearing. The existence of RNAi-induced epigenetic silencing (RNAe), capable of stable transmission through numerous generations, is a long-standing question in the field. In animals, Piwi proteins and piRNAs control transposons and maintain the integrity and functionality of the germline. The C. elegans Piwi protein, PRG-1 and its piRNAs have been recently implicated in the induction of RNAe in germline expressed single-copy transgenes. Those strains showed stable silencing with no reversion over time. The work reported here used those RNAe strains to identify genes involved in the maintenance of RNAe. Genetic crosses of RNAe strains with mutant candidate genes revealed that MUT-7, a putative exonuclease involved in 22G-RNA biogenesis, is required for RNAe. Moreover, WAGO-9, a germline nuclear Argonaute, and proteins belonging to the nuclear RNAi pathway, NRDE-1 and NRDE-2, are also required. In those crosses, RNAe was only depleted in the second homozygous generation for the candidate gene introduced, revealing a striking maternal effect. In parallel, forward genetic screens identified one hit. The hit was RNAi-sensitive, indicating that the hit does not belong to the RNAi-deficient (Rde) class. Altogether, those results support a model where 22G-RNAs, WAGOs and the NRDE pathway act together to maintain RNAe indefinitely. Reestablishment of RNAe in every generation may be explained by maternal deposition of 22G-RNAs into embryos, followed by reinforcement of chromatin marks. Furthermore, to assure perpetuation of RNAe, 22G-RNAs may be synthesized de novo in every generation. The results reported here shed light on the requirements of RNAe in the germline of C. elegans. This new paradigm may be of great importance to understand the regulation of gene expression, with implications in evolution and development.Inácio, ÂngelaKetting, RenéRepositório da Universidade de LisboaAlmeida, Miguel Duarte Dias de Vasconcelos, 1989-2012-12-14T15:39:46Z20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/7404enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:50:35Zoai:repositorio.ul.pt:10451/7404Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:32:14.170421Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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