Development of metal-linked proteolysis targeting chimeras

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vieira, Beatriz Marto
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/54118
Resumo: Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia
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spelling Development of metal-linked proteolysis targeting chimerasPROTACRutheniumRIPK2CereblonTeses de mestrado - 2021Ciências da SaúdeTese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de FarmáciaA via ubiquitina-proteossoma é um dos métodos celulares utilizados para a degradação de proteínas, onde ocorre a formação de uma cadeia de ubiquitina na proteína alvo, sinalizando-a para degradação no proteossoma. Para a formação da cadeia de ubiquitina é necessária a presença do enzima ativador de ubiquitina (E1), do enzima conjugador (E2) e do ubiquitina ligase (E3). O E1 ativa a ubiquitina, que uma vez ativada é transferida para o E2. O E3 vai servir como adaptador entre o E2 e a proteína alvo, permitindo a transferência da ubiquitina. Tirando partido da via ubiquitina-proteossoma, surgiu uma nova classe de compostos, que tem como objetivo a degradação de proteínas - os PROTACs (Proteolysis-Targeting Chimeras). Estes ligam-se simultaneamente à proteína alvo e ao E3 escolhido, permitindo que ocorra a formação de uma cadeia de ubiquitina que irá sinalizar a proteína para degradação no proteossoma. De forma a possibilitar a interação entre a proteína de interesse e o E3, os PROTACs são constituídos por três componentes: um ligando para a proteína alvo, um ligando para um E3 e um linker que une ambos os ligandos. Apesar de haver um elevado número de E3s, os PROTACs desenvolvidos têm como principais alvos o cereblon (CRBN), o von Hippel-Lindau (VHL) ou o cIAP (cellular inhibitor of apoptosis protein). O linker, para além de unir os ligandos, vai influenciar a interação entre as duas proteínas, devendo o seu tamanho e composição ser o adequado para as aproximar e permitir a transferência da ubiquitina. Uma grande variedade de proteínas já foi degradada usando PROTACs, estando a maioria relacionada com o cancro, embora algumas tenham um papel em doenças neurodegenerativas. Atualmente, encontram-se dois PROTACs em ensaios clínicos, um para o tratamento do cancro da próstata e outro da mama. Estes têm como objetivo a indução da degradação do recetor de androgénio e recetor de estrogénio, respetivamente. Uma das vantagens apontadas para o uso de PROTACs em detrimento dos inibidores de proteínas é que os PROTACs só necessitam de se ligar à proteína o tempo suficiente para que ocorra a ubiquitinação, podendo ser usados posteriormente para induzir a ubiquitinação de uma outra proteína. Por sua vez, os inibidores de proteínas, necessitam de se manter ligados à proteína para exercer o seu efeito. Deste modo, a concentração de PROTAC utilizada poderá ser inferior em comparação à do inibidor. O RIPK2 (Receptor-interacting protein Kinase 2) é um enzima que pertence às vias do NOD1 (Nucleotide binding oligomerization domain 1) e NOD2, participando na ativação do NF-κB (nuclear factor-κB). O NF-κB encontra-se associado ao IκB (inhibitor of kappa B) no citoplasma, onde permanece inativo. Para ser ativado, e poder migrar para o núcleo, é necessário que se dissocie do IκB. Nas vias do NOD1 e NOD2, o reconhecimento de peptidoglicanos bacterianos leva ao recrutamento do RIPK2 e à sua consequente polimerização. Posteriormente, o RIPK2 liga-se simultaneamente ao TAK1 (Transforming growth factor β-activated kinase 1) e ao complexo IκB cinase (IKK), através da sua subunidade IKKγ, permitindo a fosforilação da subunidade IKKβ por parte do TAK1. Uma vez fosforilado, o IKK levará à fosforilação do IκB que terá como consequências a sua dissociação do NF-κB e a sua degradação no proteossoma. O NF-κB, uma vez dissociado do IκB, poderá então migrar para o núcleo. A regulação destas vias pode ocorrer por remoção das cadeias de ubiquitina do RIPK2 ou impedimento da interação do RIPK2 com o NOD1, NOD2 ou XIAP. O papel que o RIPK2 tem nas vias do NOD1 e NOD2, faz com que seja considerado um alvo terapêutico no tratamento de patologias associadas a alterações no seu funcionamento, como a doença de Crohn, colite ulcerosa ou cancro da mama. Os complexos metálicos têm tido um papel importante quer no diagnóstico, quer no tratamento de doenças. Estes possuem características, tais como, a apresentação de maior diversidade de estruturas, devido à possibilidade de terem números de coordenação superiores a quatro, e poderem trocar ligandos com as biomoléculas, que os podem tornar atrativos em comparação com as moléculas orgânicas. Após a aprovação da cisplatina como agente anticancerígeno, houve um aumento do interesse no desenvolvimento de complexos metálicos com propriedades terapêuticas, não só de platina, mas também de ruténio, paládio, ouro ou cobre. Os complexos de ruténio têm mostrado ser promissores, tendo os complexos NAMI-A, KP1019 e IT-139 avançado para ensaios clínicos, embora nenhum tenha sido aprovado. Atualmente, encontra-se em ensaios clínicos de fase II o TLD1433, um complexo utilizado para terapia fotodinâmica. Apesar de todos os complexos de ruténio que seguiram para ensaios clínicos serem agentes anticancerígenos, também têm sido desenvolvidos complexos com o intuito de serem aplicados como antibióticos e antiparasitários. Os ligandos do centro metálico vão ter um papel importante na função que este irá adquirir. A utilização de arenos permite a intercalação com DNA. No caso dos complexos com aplicação em terapia fotodinâmica são utilizadas polipiridinas como ligandos. Se o objetivo for inibir enzimas pode ser coordenado ao centro metálico um inibidor do enzima alvo, como é o caso da inibição de cinases ao coordenar estaurosporina com um centro metálico. Neste projeto pretendemos demonstrar como a introdução de um núcleo metálico no linker do PROTAC poderá melhorar as suas propriedades físico-químicas e biológicas, como a permeabilidade, a solubilidade ou a biodistribuição. Para isso, temos como primeiro objetivo o desenvolvimento de um PROTAC orgânico que contem no seu linker uma bipiridina. O segundo objetivo será a obtenção de dois MPROTACs (metal-linked PROTACs), que diferem nos ligandos espectadores (fenantrolina ou batofenantrolina), através da coordenação da bipiridina do PROTAC orgânico com um complexo de ruténio. Tendo como modelo um PROTAC que induz a degradação do RIPK2, pretendemos desenvolver um PROTAC orgânico que leva à degradação da mesma proteína alvo, mas em vez do VHL pretendemos recrutar como E3 o CRBN. Assim, o nosso PROTAC orgânico é constituído pelo ligando do RIPK2 (24), o ligando do CRBN (28) e um linker que foi dividido em três partes: a [2,2’-bipiridina]-4,4’-dicarboxílico (26) e as porções que fazem a ponte entre a bipiridina e os ligandos (25 e 27). A síntese do PROTAC teve início na obtenção do ligando do RIPK2, onde encontramos adversidades no último passo (a desmetilação do 35), que foram resolvidas ao realizar a reação em sistema fechado. A síntese do ligando do CRBN ocorreu em dois passos, tendo sido necessário no segundo um aumento de pressão para que a reação fosse completa. Para a síntese do 25 e do 27 foi necessária a utilização de grupos protetores antes de realizar a tosilação e substituição nucleofílica, respetivamente. Uma vez com os diferentes componentes do PROTAC prontos, chegou o momento de uni-los. Em primeiro lugar, sintetizámos o composto 50, ao unir o ligando do RIPK2 e o 25, sem adversidades. O passo seguinte foi a condensação do 26 com o 27, no entanto, não obtivemos os resultados esperados. Como alternativa, convertemos os ácidos carboxílicos do 26 em cloretos de acilo antes de realizarmos a condensação com o 27 e metanol. Com este método, obtivemos resultados positivos apenas quando se encontrava presente piridina. Ao repetir a condensação, desta vez com 50 em vez de metanol, obtivemos 54 e 55, no entanto não foi possível purificar nenhum deles. Embora não tenhamos conseguido cumprir nenhum dos objetivos a que nos propusemos, fizemos avanços nesse sentido.PROTACs (Proteolysis-Targeting Chimeras) are molecules that induce the degradation of proteins through the ubiquitin-proteasome pathway. They will bind simultaneously the POI (protein of interest) and the chosen E3 (ubiquitin-protein ligase), leading to the formation of a ubiquitin chain in the POI. The ubiquitin chain works as a tag that marks the protein for degradation in the proteasome. To bring these two proteins together, PROTACs are composed of three components: the POI ligand, the linker and the E3 ligand. Several different proteins have been degraded using PROTACs and their optimization has been made by recruiting different E3s or varying the length and composition of the linker. With this work, we intended to show that the introduction of a metal core in the linker of a PROTAC could improve its physicochemical and biological properties. To do so, we had as a first goal the development of an organic PROTAC that would bear a bipyridine in its linker. This organic PROTAC was based in a previously reported PROTAC that induces the degradation of RIPK2 (receptor-interacting protein kinase 2), an enzyme that has a role in the NOD1 (nucleotide binding oligomerization domain 1) and NOD2 pathways and is involved in diseases such as Chron’s disease and ulcerative colitis. The second goal of this work would be the coordination of the organic PROTAC with a ruthenium complex through the bipyridine. We have sectioned the organic PROTAC into five parts: the RIPK2 ligand (24), the E3 ligand (28), the ether linkers, tert-butyl 2-(2-hydroxyethoxy)acetate (27) and the 2-(2-((tert-butyldiphenylsilyl)oxy)ethoxy)ethyl 4-methylbenzenesulfonate (25), and the [2,2'-bipyridine]-4,4'-dicarboxylic acid (26). Even though we were unable to fulfill the goals of this project, there are some accomplishments worth noting, such as: we were able to synthesize the different components of our PROTAC (24, 25, 27 and 28), we were able to synthesize 2-(2-((4-(benzo[d]thiazol-5-ylamino)-6-(tert-butylsulfonyl)quinolin-7-yl)oxy)ethoxy)ethanol (50) and, after the success in the cross condensation of 26 with 27 and MeOH in the presence of pyridine, we tried the cross condensation with 27 and 50 and obtained 4-(2-(2-((4-(benzo[d]thiazol-5-ylamino)-6-(tert-butylsulfonyl)quinolin-7-yl)oxy)ethoxy)ethyl) 4'-(2-(2-(tert-butoxy)-2-oxoethoxy)ethyl) [2,2'-bipyridine]-4,4'-dicarboxylate (54) and 4'-((2-(2-((4-(benzo[d]thiazol-5-ylamino)-6-(tert-butylsulfonyl)quinolin-7-yl)oxy)ethoxy)ethoxy)carbonyl)-[2,2'-bipyridine]-4-carboxylic acid (55), although were unable to purify neither.Com o patrocínio do iMed.ULisboa, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.Florindo, Pedro Ricardo da RochaMoreira, Rui Ferreira AlvesRepositório da Universidade de LisboaVieira, Beatriz Marto2022-08-11T14:09:40Z2021-03-042021-01-292021-03-04T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54118TID:203012623enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:00:29Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54118Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:05.426843Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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