Development of new necroptosis inhibitors: targeting RIP1 kinase

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Roque, Maria Inês Lopes
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/63096
Resumo: Tese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Development of new necroptosis inhibitors: targeting RIP1 kinaseProgrammed cell deathNecroptosisRIPK1 inhibitors1,3-thiazoleHit-tolead optimizationTeses de mestrado - 2023Ciências da SaúdeTese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A morte celular é caracterizada como um processo intrínseco da célula que ocorre quando os mecanismos de defesa são insuficientes ou quando se pretende eliminar células danificadas/infetadas, originando uma lesão celular irreversível. Alguns dos processos essenciais nos quais a morte celular é imprescindível e nos quais levará à manutenção da homeostase envolvem: o desenvolvimento embrionário, a organogénese, o envelhecimento celular e a defesa contra patógenos. Para que uma célula seja considerada morta, é necessário que, pelo menos, um destes processos ocorra: perda da integridade da membrana plasmática, fragmentação do núcleo da célula e/ou fagocitose por células adjacentes. O processo de morte celular poderá ainda ocorrer de diversas formas, nomeadamente, por conta de mutações no ADN, vírus, toxinas, distúrbios nutricionais, alterações no sistema imunitário do organismo ou hipoxia. Ao longo dos anos, com a constante evolução tecnológica, foi possível identificar e caracterizar novos mecanismos moleculares, morfologias, estímulos, características bioquímicas e funcionais de diferentes tipos de morte celular, levando a uma abrangente definição deste processo. Por conta disto, e numa forma de facilitar a comunicação entre cientistas de todas as áreas académicas, foi necessário proceder à classificação dos diferentes tipos de morte celular através do Comité de Nomenclatura de Morte Celular. Em 2018, este comité sugeriu uma nova designação que classificou a morte celular como um processo acidental ou regulado. O primeiro, cuja forma representativa seria a necrose clássica, é baseada em processos patológicos ou não-fisiológicos, sem qualquer via de sinalização e resultantes de lesões inesperadas. Já a morte celular regulada seria um processo no qual uma célula é eliminada em resposta a um conjunto inerente e geneticamente definido de eventos moleculares em condições fisiológicas. Durante muito tempo, a apoptose foi considerada o único tipo de morte celular regulada. No entanto, estudos recentes, mostram que um tipo específico de necrose poderá ser altamente regulado num processo designado por necroptose ou necrose programada contendo uma morfologia similar à necrose e envolvência de genes e mecanismos complexos de sinalização e modificações pós-translacionais semelhantes à apoptose. Necroptose é um tipo de morte celular regulada e independente das caspases caracterizada em 2005 após a descoberta de um importante inibidor, Necrostatina-1, que viria a ser reconhecido como o impulsionador da descoberta de novos inibidores da RIPK1. Diversos estudos publicados ao longo dos anos, consideram a necroptose como contribuidor maioritário na progressão de doenças humanas como pancreatite, lesão isquémica, doenças neurodegenerativas, doenças inflamatórias, sepsis, cancro, entre outras. Uma das características mais importantes da necroptose é a resposta inflamatória associada devido à libertação de certas moléculas ativadoras que provocarão uma intensa resposta imunológica da célula por parte dos seus recetores. Esta resposta, poderá, em certos casos, ser prejudicial caso haja uma hiperinflamação. Sendo assim, estudar a inibição da necroptose, poderá ser uma forma de entender um pouco melhor a maquinaria genética por detrás deste processo de morte celular. Em relação ao mecanismo por detrás da necroptose, sabe-se que este tipo de morte celular funciona como um reforço quando a apoptose é bloqueada, especificamente, quando estão presentes inibidores de caspases ou quando o gene que codifica as caspases é nocauteado ou silenciado. Ambos estes processos de morte celular são mediados pelo recetor de interação de cinases de proteínas serina / treonina (RIPK1), e onde, adicionalmente, os recetores posteriores RIPK3 e a pseudocinase MLKL são também importantes para a mediação da necroptose. O estudo da necroptose em prol da apoptose torna-se interessante devido à escassez de alvos terapêuticos na apoptose e de certas preocupações relativamente à segurança da utilização de inibidores da apoptose levando a um uso bastante limitado na prática clínica. Assim, explorar a maquinaria molecular da necroptose e a sua inibição poderá levar ao desenvolvimento de estratégias que possam dar suporte a novas abordagens terapêuticas, bem como, ultrapassar problemas relacionados com as resistências terapêuticas atuais. Apesar da existência de dois inibidores da RIPK1 pertencentes à empresa farmacêutica GlaxoSmithKline que se encontram presentemente em ensaios clínicos, ainda nenhum inibidor dos marcadores da necroptose conseguiu chegar ao mercado. Isto porque, a grande maioria, apresenta várias limitações a nível farmacológico incluindo biodisponibilidade limitada, baixa especificidade com atividade em várias outras cinases muito semelhantes entre si e efeitos secundários. Assim sendo, a investigação de novos quimiotipos com diferentes modos de ação torna-se urgente de forma a abordar a escassez de inibidores da necroptose para o desenvolvimento clínico. A presente tese foca-se na síntese de uma vasta biblioteca de compostos derivados da molécula líder AZ12651922, selecionada através de um screening fenotípico desenvolvido pelo iMed.Ulisboa e com a colaboração da AstraZeneca para a identificação de compostos com atividade inibitória contra marcadores da necroptose, nomeadamente a RIPK1. Tendo em conta o espaço químico em torno do tiazole 2,5- disubstituído (núcleo central da molécula líder e estrutura altamente estudada na química medicinal) e estudos de estrutura-atividade posteriores feitos no nosso grupo, as características estruturais referidas nesta tese, debater-se-ão com: inserção de grupos doadores de eletrões na posição 2 do anel de tiazole, inserção de três tipos diferentes de heterociclos na posição 5 e alquilações de cadeia curta (metilações). A escolha da utilização de grupos doadores de eletrões iniciou-se pelos resultados obtidos com o composto BCC_AZ028_fA, um análogo da molécula líder AZ12651922. Este composto contendo um grupo metilo em posição para como grupo doador de eletrões, foi o único composto com esta propriedade sintetizado na altura, apresentando capacidade inibitória comparável a Necrostatina-1 e valores de EC50 comparáveis à molécula líder. Sendo assim, mais análogos contendo grupos doadores de eletrões foram então considerados. Contabilizando os compostos finais como os alquilados, foram sintetizados 24 compostos finais que foram caracterizados através de ressonância magnética nuclear monodimensional 1H, 13C e bidimensionais (COSY, NOESY, HSQC e HMBC) bem como espetrometria de massa de alta resolução. Seguidamente, recorreu-se a um screening enzimático primário para selecionar os compostos quanto à sua atividade inibitória para a hRIPK1 a concentração de 5 μM. Para além destes compostos alquilados, também se decidiu testar as 15 aminas correspondentes para uma mesma concentração. A fim de validar o método, utilizou-se a Necrostatina-1 também a 5 μM para comparar os resultados. A atividade inibitória da molécula líder AZ12651922 e do análogo BCC_AZ028_fA, foram também estudadas a fim de verificar se as alterações estruturais feitas nos novos análogos promoveram algum aumento de atividade inibitória. Os resultados obtidos indicam que para a maioria dos casos, os compostos metilados possuem atividade inibitória superior às das correspondestes aminas, com exceção dos compostos 32 e 37, ambos aminas e com maior taxa inibitória. Adicionalmente, os compostos 3, 7, 32 e 35 apresentaram capacidades inibitórias superiores à Necrostatina-1 e ao análogo BCC_AZ028_fA. Os compostos 32 e 35 são os que apresentaram a maior taxa inibitória, ainda superior à da molécula líder AZ12651922. As modificações realizadas à molécula líder sugerem que a introdução do grupo benzeno ou tiofeno adjacente à cetona não possui correlação direta com o aumento ou diminuição da atividade inibitória se a tipologia do grupo doador de eletrões não for considerada. É preciso analisar o grupo doador na posição 2 do tiazole e o heterociclo na posição 5 do tiazole para tirar conclusões mais relevantes. Inserir substituintes como grupos metil ou metoxi em posição para ou meta só fará diminuir a atividade inibitória comparativamente ao anel benzóico não substituído. Uma modificação benéfica para a atividade inibitória será o aumento da flexibilidade da molécula dada por uma maior distância entre a amina e o grupo doador de eletrões, neste caso um benzeno, através da inserção de grupos metileno. Os resultados obtidos para os compostos 42 e 43, contendo o grupo benzofurano como o terceiro heterociclo diferente adjacente à cetona, não foram considerados pois os respetivos ensaios não correram bem e terão de ser repetidos no futuro.Necroptosis, a regulated necrotic cell death, is a newly discover process that is activated under apoptosis-deficient conditions and controlled by the activity of receptor-interacting serine/threonine-protein kinase (RIPK) 1 and 3 and pseudokinase MLKL. Several studies published over the years account necroptosis and RIPK1 as main contributors in the progression of human diseases such as, neurodegenerative, and inflammatory diseases, sepsis, viral infections or cancer. Currently, the number of necroptosis inhibitors targeting RIPK1 under investigation or in clinical trials are quite limited. Limitations of necroptosis inhibitors are related with limited bioavailability, absence of inter-species cross-activity, poor specificity, and off-target effects. Therefore, strategies targeting necroptosis signaling pathway and RIPK1 may open new avenues for the development of novel clinical treatments that can overcome some therapeutic resistance. Recently, a phenotypic high-throughput screening was carried out at iMed.ULisboa using a library of more than 250,000 compounds (AstraZeneca) in order to identify new compounds with antinecroptotic activity. Several hit compounds with different scaffolds were identified. This thesis reports the design, synthesis and biological evaluation of a diversified chemical library based on hit compound AZ12651922 containing a 2,5- disubstituted thiazole core structure. Probing the chemical space around the thiazole core structure, 22 novel alkylated analogues and 14 novel amines functionalized with different electron donating groups were synthetized and screened in an enzymatic assay against hRIPK1 at 5 μM. All final compounds were fully characterized using mono- and bi-dimensional NMR and high-resolution mass spectrometry (HRMS). Results show that the alkylated compounds, in their majority, have higher inhibitory activity than the correspondent amines except for compounds 32 and 37. It was also observed that the nature of the electron-donating group (EDG) present at position 2 of the thiazole ring has a major impact in inhibitory activity rather than the heterocycle present in position 5. Increasing the molecule flexibility through the insertion of methylene linkers between the EDG and the amine has a positive impact in the inhibitory activity.Faculdade de Farmácia, Instituto de Investigação do Medicamento (iMed.ULisboa) - Grupo "Medicinal Chemistry".Ressurreição, Ana Sofia Marques daMoreira, Rui Ferreira AlvesRepositório da Universidade de LisboaRoque, Maria Inês Lopes2023-12-202023-11-302026-12-20T00:00:00Z2023-12-20T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/63096TID:203466640enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-04T01:21:23Zoai:repositorio.ul.pt:10451/63096Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:12:35.665325Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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