Novas abordagens para purificação de plasmídeos em sistemas de duas fases aquosas

• Autor(a) principal: Oliveira, Andreia Daniela da Silva
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/3876
• topic: Terapia genética; Plasmídeos; Polietilenoglicol; Hidroxipropilamido; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química

A necessidade cada vez mais frequente de DNA plasmídico (pDNA) para ser usado em Terapia Génica e vacinas de DNA levou à procura de novos meios de recuperação e purificação de plasmídeos que possam ser utilizados em larga escala. Os Sistemas de Duas Fases Aquosas (SDFAs) têm sido testados para esse fim pois são uma técnica fácil, simples e eficaz. Contudo, devido à sua baixa selectividade, têm sido maioritariamente utilizados nos passos iniciais da purificação. Os sistemas Dextrano (Dex)/Polietilenoglicol (PEG) são os melhores estudados mas apresentam a desvantagem do Dextrano ser um polímero de elevado custo. O Hidroxipropilamido (HPS) tem sido utilizado como substituto para o Dex, baixando o custo da operação cerca de sete vezes, contudo nunca foi utilizado para a purificação de pDNA. Nos SDFAs também se têm utilizado ligandos de afinidade para o pDNA, de modo a aumentar a afinidade do pDNA para a fase do PEG, havendo assim uma maior percentagem de recuperação do produto. Contudo, os ligandos normalmente utilizados têm a desvantagem de serem caros, tendo anteriormente sido estudados alguns antibióticos como potenciais ligandos de afinidade para o pDNA. Dos antibióticos estudados, o Berenil revelou-se o mais promissor pois apresenta uma elevada constante de afinidade para o pDNA. Assim, o principal objectivo deste trabalho consistiu em testar sistemas HPS/PEG para a recuperação de pDNA e na utilização do Berenil como ligando de afinidade sendo para isso necessário ligá-lo ao PEG. A partição do pDNA e do RNA em vários sistemas HPS/PEG foi estudada através de electroforeses em gel de agarose e a determinação da concentração de pDNA nas fases dos sistemas foi realizada por fluorescência e cromatografia de interacção hidrofóbica. A influência de vários sais no comportamento do pDNA e do RNA foi igualmente avaliada. Assim, em sistemas com HPS e lisado, o pDNA precipita na interfase dos sistemas e o RNA particiona maioritariamente para a fase superior. O pDNA puro em sistemas com HPS particiona da fase superior para a fase inferior, com o aumento da concentração de sal, verificando-se portanto a influência da elevada concentração de sais presentes nas soluções de lise alcalina. Verifica-se que, com a substituição do Dex por HPS, o comportamento do pDNA altera-se no SDFA. Para sistemas com Dex e pDNA puro, o pDNA particiona para a fase inferior dos sistemas, independentemente da concentração de sal presente. Contudo em sistemas com HPS, o pDNA tende a particionar para a fase superior dos sistemas, passando para a fase inferior com o aumento da concentração de sal. Todos os sais estudados influenciam de igual modo o comportamento do pDNA puro nos sistemas, fazendo com que ele particione da fase superior para a fase inferior, podendo estes ser usados para melhorar a separação entre o pDNA e os seus contaminantes. A ligação do Berenil ao PEG utilizando diferentes protocolos não foi conseguida, tendo-se obtido, em todas as reacções realizadas, os reagentes de partida.