Role of the N-glycolylation of mycobacterial peptidoglycan in host immune recognition and antibiotic resistance
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| Data de Publicação: | 2020 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/54078 |
Resumo: | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia. |
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Role of the N-glycolylation of mycobacterial peptidoglycan in host immune recognition and antibiotic resistanceTuberculosisMycobacterial cell wallPeptidoglycan modificationsAntibiotic resistanceHost-pathogen interactionsTeses de mestrado - 2021Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Nos últimos anos, a tuberculose (TB) tornou-se uma emergência de saúde global, principalmente devido ao surgimento de estirpes multirresistentes e extensivamente resistentes do seu agente etiológico, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Este problema é acentuado pela relativa ineficácia da vacina BCG e dos agentes antimicobacterianos atualmente conhecidos e, pela falta de alternativas terapêuticas para a TB. Com quase dois milhões de mortes por TB anualmente, é urgente encontrar uma vacina eficaz contra a doença, desenvolver ferramentas de diagnóstico rápido e criar melhores esquemas de tratamento. Assim, é fundamental um melhor esclarecimento do mecanismo da patogénese da TB, que é atualmente mal compreendido, devido à estrutura altamente complexa da parede celular micobacteriana. A camada de peptidoglicano (PG) da parede celular micobacteriana é particularmente relevante, uma vez que apresenta modificações únicas, das quais a N-glicolilação do ácido murâmico, catalisada pela atividade da hidroxilase do ácido N-acetil murâmico (NamH), é de especial interesse. Estudos anteriores demonstraram que a N-glicolilação do PG promove a resistência a antibióticos β-lactâmicos e à lisozima. Da mesma forma, outros estudos demonstraram que a N-glicolilação do PG parece estimular a imunogenicidade da parede celular micobacteriana. Apesar de não ser um gene essencial, o namH é altamente conservado em estirpes clínicas de Mtb, o que indica que a N-glicolilação do PG possui uma função importante na resistência a antibióticos e/ou na patogénese da TB. Assim, o objetivo principal desta tese foi modular a expressão do namH de modo a compreender a importância da N-glicolilação do PG micobacteriano na resistência aos antibióticos e no reconhecimento das micobactérias por parte do hospedeiro. Para isso, vários mutantes knockdown do namH (namH-) foram construídos em M. smegmatis e M. tuberculosis H37Ra, usando uma nova e eficaz ferramenta molecular de regulação da transcrição, o CRISPR de interferência (CRISPRi). Esta técnica baseia-se na expressão induzida, com anidrotetraciclina (ATc), de um complexo dCas9-sgRNA para impedir a transcrição da sequência alvo, o que permite a investigação da função do gene de interesse, neste caso do namH. Os mutantes knockdown do namH construídos em M. smegmatis foram caracterizados através da realização de várias experiências: curvas de crescimento e plaqueamento de diluições seriadas de cada cultura numa área circular delimitada designada por spot. Estas experiências mostraram que quer a deleção quer a repressão do gene namH não origina defeitos graves no crescimento de M. smegmatis, confirmando-se assim que este gene não é essencial. Além disso, foi possível observar um nível residual de toxicidade da dCas9Sth1 durante as curvas de crescimento, ao verificar-se que o controlo M. smegmatis:PLJR962 cresce ligeiramente mais devagar na presença de indutor. Embora não tenha sido possível confirmar a repressão do namH em todos os mutantes knockdown, a repressão deste gene no mutante knockdown induzido M. smegmatis C2 ATc foi avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e confirmada. Além disso, constatou-se que o CRISPRi provoca polaridade, ou seja, uma diminuição significativa da transcrição do gene a jusante. No entanto, não foi possível investigar de que modo a força da PAM escolhida, a cadeia de DNA alvo e o local alvo afetam a eficiência do CRISPRi. De seguida, o papel da N-glicolilação do PG na suscetibilidade a vários antibióticos foi investigado através da realização de ensaios para determinar a concentração mínima inibitória (CMI) e a concentração mínima bactericida (CMB) de diversos β-lactâmicos (amoxicilina, cefotaxima, meropenem), na presença e ausência do inibidor de β-lactamase clavulanato, e de alguns agentes antimicobacterianos (etambutol e isoniazida) para todos os mutantes knockdown em M. smegmatis, na presença e ausência de indutor. Os resultados obtidos mostraram que o meropenem é mais eficiente ao inibir o crescimento das micobactérias do que a amoxicilina ou a cefotaxima. Este efeito parece ser causado pela resistência inerente do meropenem às β-lactamases micobacterianas e, também, devido a uma inibição simultânea de L,D-transpeptidases e, algumas D,D-transpeptidases e D,D-carboxipeptidases. Além disso, constatou-se que a N-glicolilação do PG tem um papel significativo na resistência aos β-lactâmicos, uma vez que tanto o mutante de deleção do namH (ΔnamH) quanto os mutantes knockdown induzidos exibiram um fenótipo de suscetibilidade à maioria dos β-lactâmicos. Da mesma forma, foi observada uma correlação relevante entre a N-glicolilação do PG e o mecanismo de ação da cefotaxima pois os mutantes namH- exibiram uma diminuição particularmente significativa da CMI da cefotaxima ou da cefotaxima-clavulanato na presença de indutor. Verificou-se ainda que a principal β-lactamase de M. smegmatis (BlaS) hidrolisa os antibióticos β-lactâmicos com diferente eficiência, pois a adição de clavulanato aos β-lactâmicos diminuiu consideravelmente a CMI da amoxicilina, o que não aconteceu no caso da cefotaxima e do meropenem. Os ensaios de CMB mostraram que todos os β-lactâmicos possuem atividade bactericida para a maioria das amostras de M. smegmatis testadas, o que indica que a N-glicolilação do PG não afeta consideravelmente a capacidade dos β-lactâmicos matarem as micobactérias. No entanto, verificou-se que a indução do sistema de CRISPRi pareceu aumentar a atividade bactericida dos β-lactâmicos em alguns casos, em que os mutantes knockdown do namH eram mais facilmente mortos na presença de indutor. Os ensaios de difusão em disco permitiram a determinação das zonas de inibição do meropenem para todos os mutantes knockdown construídos em M. smegmatis, com e sem indutor. Tal como tinha sido demonstrado anteriormente, os resultados destes testes sugeriram que a proteína NamH desempenha um papel na resistência ao meropenem, pois tanto o mutante de deleção do namH (ΔnamH) quanto os mutantes de knockdown do namH induzidos exibiram um fenótipo exacerbado de hipersuscetibilidade ao meropenem. Estas experiências demonstraram que os mutantes de deleção/repressão do namH são mais suscetíveis à maioria dos β-lactâmicos. Este “fenótipo de hipersuscetibilidade aos β-lactâmicos” pode, então, ser explicado pela inibição: i) da atividade hidrolítica de β-lactamase da NamH; ii) da atividade de monooxigenase/hidroxilase da NamH, que modifica os açúcares do PG micobacteriano; iii) ambas as atividades, permitindo uma sinergia entre a inibição da atividade de β-lactamase e a inibição da N-glicolilação do PG. De facto, a redução da atividade de hidroxilase da NamH tem como consequências: i) a diminuição da integridade do PG devido a uma menor disponibilidade de grupos N-glicolil para estabelecer ligações de hidrogénio; ii) a alteração da polimerização do PG devido a uma menor disponibilidade de precursores do PG que estejam N-glicolilados. Assim, a deleção/repressão do namH pode ser utilizada em sinergia com o tratamento com β-lactâmicos para diminuir a integridade do PG micobacteriano. A contribuição da N-glicolilação do PG para o reconhecimento pelo sistema imunitário do hospedeiro foi avaliada através da realização de infeções de macrófagos de ratinho RAW 264.7 com um mutante namH- selecionado, M. smegmatis C2. Verificou-se que os macrófagos são mais eficazes a erradicar o mutante de knockdown induzido C2 ATc do que qualquer outra bactéria no t=24h, o que sugere que a presença do PG N-glicolilado promove a sobrevivência intracelular, possivelmente ao aumentar o fitness das micobactérias dentro dos macrófagos. Esta observação parece indicar que a N-glicolilação do PG provoca um menor reconhecimento das micobactérias por parte dos macrófagos, o que não é unânime visto que grande parte dos estudos anteriores verificou que a N-glicolilação do PG potencia o reconhecimento imunológico e a subsequente resposta imune. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta tese ajudou a esclarecer o papel da N-glicolilação do PG na suscetibilidade aos antibióticos, ao levantar novas hipóteses sobre a forma como a proteína NamH promove a resistência aos β-lactâmicos. Do mesmo modo, esta tese também levantou questões importantes sobre o papel da N-glicolilação do PG nas interações patogénio-hospedeiro, nomeadamente ao nível do reconhecimento imune. Os resultados apresentados e as conclusões alcançadas poderão ser relevantes para uma melhor compreensão da patogénese da TB e para o desenvolvimento de terapêuticas alternativas para o tratamento da TB, no futuro.n the past years, tuberculosis (TB) has become a global health emergency, namely due to the emergence of multi-drug and extensively-drug resistant strains of its etiologic agent, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). This problem is accentuated by the relative ineffectiveness of the BCG vaccine and of currently known antimycobacterial agents and, by the lack of alternative TB therapeutics. The pathogenesis of Mtb is poorly understood due to the highly complex structure of the cell wall (CW). The peptidoglycan (PG) layer of the mycobacterial CW is specifically relevant since it features unique modifications, of which the N-glycolylation of PG muramic acid, catalyzed by the activity of the N-acetyl muramic acid hydroxylase (NamH), is of special interest. Previous studies have demonstrated that the N-glycolylation of PG increases β-lactams/lysozyme resistance as well as the immunogenicity of the mycobacterial CW. Despite not being essential, the namH gene is highly conserved in Mtb clinical isolates, implying a vital function for the N-glycolylation of PG in antibiotic resistance or/and in TB pathogenesis. Therefore, the main goal of this thesis was to modulate namH expression in order to understand the significance of the N-glycolylation of mycobacterial PG in antibiotic resistance and in host immune recognition. To do that, several namH knockdown (namH-) mutants were constructed in both M. smegmatis and M. tuberculosis H37Ra, using a new effective transcription regulation tool, CRISPR interference (CRISPRi). This technique employs a dCas9-sgRNA complex to repress any target gene by sterically hindering its transcription, thus, enabling the inquiry of the functional significance of namH. The M. smegmatis namH- mutants were phenotypically characterized by performing growth curves and spotting dilutions. These experiments demonstrated that namH knockout/repression does not produce severe growth defects, thus, confirming the non-essentiality of namH. Moreover, a residual level of dCas9Sth1 toxicity was uncovered by performing growth curves. Although it was not possible to confirm the repression of namH in all knockdown mutants, the repression of namH in the induced knockdown mutant M. smegmatis C2 in the presence of anhydrotetracycline (ATc) was assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and confirmed. Furthermore, CRISPRi was found to cause a significant level of downstream polarity. Nevertheless, it was not possible to probe how the strength of the employed PAM, the targeted DNA strand and the target site affect the efficiency of CRISPRi. In addition, the role of the N-glycolylation of PG in antibiotic susceptibility was determined by performing minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) assays for all M. smegmatis namH knockdown mutants, with and without inducer (ATc). The MIC assays showed that meropenem is more efficient at inhibiting the growth of mycobacteria, when compared to amoxicillin or cefotaxime. Besides, the N-glycolylation of PG was found to have a role in β-lactams resistance, as both M. smegmatis ΔnamH and the induced knockdown mutants exhibited increased susceptibility to most β-lactams. Likewise, a strong link between the N-glycolylation of PG and the mechanism of action of cefotaxime was uncovered, as the namH knockdown mutants displayed a particularly significant decrease in MIC values for cefotaxime or cefotaxime-clavulanate in the presence of inducer. Furthermore, differences in the hydrolytic efficiency of the main β-lactamase of M. smegmatis (BlaS) to various β-lactams were verified as the addition of clavulanate to β-lactams considerably decreased the MIC of amoxicillin, as opposed to cefotaxime and meropenem. The MBC assays showed that all β-lactams were bactericidal against most of the tested M. smegmatis samples, indicating that the N-glycolylation of PG does not severely affect the killing activity of β-lactams. Subsequently, the disk diffusion assays enabled the assessment of the meropenem zones of inhibition for all M. smegmatis knockdown mutants, with and without inducer. These experiments suggested that NamH plays a role in meropenem resistance as both M. smegmatis ΔnamH and the induced namH knockdown mutants displayed an exacerbated meropenem hypersusceptibility phenotype. Overall, these antibiotic susceptibility tests demonstrated that the namH knockout/knockdown mutants display increased susceptibility to most β-lactams. This “β-lactams hypersusceptibility phenotype” may be explained by the inhibition of: i) the hydrolytic activity of NamH as a β-lactamase; ii) the activity of NamH as a monooxygenase, which modifies PG sugars; iii) both activities, enabling a synergy between the inhibition of β-lactamase activity and the inhibition of the N-glycolylation of PG. Indeed, the reduced hydroxylase activity of NamH can lead to: i) decreased PG integrity due to a lower availability of N-glycolyl groups to establish hydrogen bonds; ii) altered PG polymerization due to a lower availability of N-glycolylated PG precursors. The contribution of the N-glycolylation of PG in host immune recognition and pathogenesis was assessed by performing infections of RAW 264.7 macrophages with a selected namH- mutant. Macrophages were found to be more effective at killing the induced knockdown mutant C2 ATc than any other bacteria at t=24h, suggesting that the presence of N-glycolylated PG promotes intracellular survival, possibly by increasing the fitness of mycobacteria inside macrophages. In conclusion, the work presented in this thesis helped enlighten the role of the N-glycolylation of PG in antibiotic susceptibility by posing new hypothesis as to how NamH enables β-lactams resistance and raised important questions about the role of the N-glycolylation of PG in host-pathogen interactions, which may lead to a better understanding of TB pathogenesis in the future.Com o patrocínio da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e do iMed.ULisboa.Catalão, Maria JoãoRepositório da Universidade de LisboaSilveiro, Cátia Raquel Lopes2024-01-04T01:34:00Z2021-01-042020-11-272021-01-04T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54078TID:202992144enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-01-08T01:16:40Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54078Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:04.355071Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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