Caracterização preliminar da bioenergética do efluxo pelo sistema AcrAB-TolC em Escherichia coli

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: COSTA, Susana Cristina Nunes Santos
Data de Publicação: 2010
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/5350
Resumo: A resistência aos antibióticos em bactérias Gram-negativas pode ser aumentada pela extrusão de antibióticos através de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo é o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energética a força proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergética na actividade de efluxo de E. coli usando três estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um método fluorimétrico semi-automático no qual a fluorescência do fluorocromo brometo de etídeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medição em tempo real da actividade de efluxo e acumulação de fluorocromo (inibição do efluxo). A utilização de brometo de etídeo é particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescência no exterior da célula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este método é uma nova aplicação do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o cálculo da cinética de transporte reflectindo o balanço entre acumulação de substrato por difusão passiva através da membrana e a sua extrusão/efluxo, proporcionando uma detecção rápida e económica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulação e o efluxo do brometo de etídeo. De todos os inibidores de vias biossintéticas testados, o ortovanadato de sódio, foi o que demonstrou maior actividade inibitória, a qual é revertida na presença de GLU. Em conclusão, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende não só da fosforilação oxidativa por via da força proto-motriz mas também da energia proveniente da hidrólise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sódio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterização bioenergética da actividade de bombas de efluxo e permite a selecção de novos inibidores de bombas de efluxo em bactérias.
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A utilização de brometo de etídeo é particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescência no exterior da célula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este método é uma nova aplicação do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o cálculo da cinética de transporte reflectindo o balanço entre acumulação de substrato por difusão passiva através da membrana e a sua extrusão/efluxo, proporcionando uma detecção rápida e económica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulação e o efluxo do brometo de etídeo. De todos os inibidores de vias biossintéticas testados, o ortovanadato de sódio, foi o que demonstrou maior actividade inibitória, a qual é revertida na presença de GLU. Em conclusão, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende não só da fosforilação oxidativa por via da força proto-motriz mas também da energia proveniente da hidrólise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sódio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterização bioenergética da actividade de bombas de efluxo e permite a selecção de novos inibidores de bombas de efluxo em bactérias.Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria can be increased by extrusion of the antibiotic through efflux systems. In Escherichia coli, the major efflux pump system is the AcrAB-TolC which is mainly driven by energy coming from the proton motive force. In this work was studied basic aspects of the bioenergetics of the efflux activity of E. coli using three genotipically and phenotipically well characterized strains. It was used the semi-automated fluorimetric method that utilizes the fluorochrome ethidium bromide, a known fluorescent efflux pump substrate, which allows the real time measurement of efflux activity and efflux inhibition (accumulation). Ethidium bromide has been shown to be particularly suitable to be used as a probe because it emits weak fluorescence outside the bacterial cell and becomes strongly fluorescent inside the cell. This method is a new application of the RotorGeneTM 3000 real-time thermocycler and provides the sum of transport kinetics reflecting the balance between accumulation of substrate via passive diffusion through the membrane permeability barrier and extrusion via efflux, thereby offers a rapid and inexpensive screening of inhibitors. The results obtained show, for all strains, that GLU and pH affects the accumulation and efflux of ethidium bromide. From all the inhibitors of energy biosynthetic pathways tested, sodium orthovanadate was the one that revealed the highest inhibitory activity and this inhibitory effect was reversed by the presence of GLU in the medium. In conclusion, this study shows the dependence of the efflux activity of E. coli on energy from the hydrolysis of ATP by the ATPases, besides the already known dependence on the oxidative phosphorylation, to maintain the proton motive force of the cells. Sodium orthovanadate has potential to be a new broad range efflux-pump inhibitor. The technology used in this work showed to be suitable for the characterization of the bioenergetic requirements of the bacterial efflux pump activity, allowing the screening of new efflux pump inhibitors.Instituto de Higiene e Medicina TropicalVIVEIROS, MiguelRUNCOSTA, Susana Cristina Nunes Santos20102010-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10362/5350porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T03:35:50Zoai:run.unl.pt:10362/5350Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:16:13.528446Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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