Characterization of the effect of cartilage acidic protein (CRTAC) on human monocytes THP-1 cells

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Coelho, André da Soledade Carruna
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.1/9871
Resumo: Dissertação de mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016
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spelling Characterization of the effect of cartilage acidic protein (CRTAC) on human monocytes THP-1 cellsCRTACTHP-1HEK 293Localização subcelularAdesão celularAgregação celularDomínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e TecnologiasDissertação de mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016Cartilage acidic protein 1 (CRTAC1) is an extracellular matrix protein of chondrogenic tissue associated with several diseases, such as multiple sclerosis. crtac duplicates emerged in teleost fish as a result of the teleost specific whole genome duplication. The poorly characterized function of CRTAC’s was the starting point of the present study. RT-PCR and Western blot analysis demonstrated that the HEK 293 cell line expresses human (h) CRTAC1. In silico analysis of the protein using bioinformatic tools indicated that hCRTAC1 and sea bass (Dicentrarchus labrax, dl) CRTAC1 and CRTAC2 proteins is most likely located in mitochondria, lysosomes, golgi apparatus and endoplasmic reticulum. Western blot analysis of subcellular fractions of HEK 293 cells indicated that hCRTAC1 is present in the nucleus, endoplasmatic reticulum and mitochondria. Trypan blue exclusion assay with THP-1 cells, indicated that dlCRTAC1 has an inhibitory effect on cell proliferation, did not promote cell death and increased cell adherence with an IC50 of 78.45ng/mL and dlCRTAC2 at 95.50ng/mL after 72 hours of cells incubation. In Hanging drop assays, dlCRTAC1 (30ng/mL) increased the size of THP-1 spheroids and the circularity of the spheroids increased when incubated with dlCRTAC1 (3 and 30ng/mL) and hCRTAC1 (3 and 30ng/mL), for 72 hours. Wound scratch assays with HEK 293 cells, indicated that dlCRTAC1 (0.03ng/mL), dlCRTAC2 (300ng/mL) and hCRTAC1 (0.03 and 0.3ng/mL) inhibited wound healing and that dlCRTAC1 (30ng/mL) and hCRTAC1 (300ng/mL) promoted wound healing, after 18 hours of incubation. In motility assays with macrophage, dlCRTAC1 (300ng/mL) increased cell motility and dlCRTAC2 (30ng/mL) inhibited macrophage motility. These results suggest that CRTAC proteins inhibit THP-1 cells proliferation but promote their adhesion and aggregation and dlCRTAC1 increased and dlCRTAC2 inhibited macrophage motility. Wound healing assays with HEK293 cells revealed that low concentrations of CRTAC inhibited wound healing and higher concentrations promoted wound healing.A proteína acídica da cartilagem 1 (CRTAC1), também conhecida por proteína expressa por condrócitos 68 kDa (CEP-68), é uma proteína da matriz extracelular da camada condrogénica da cartilagem, utilizada como marcador in vitro para diferenciação entre condrócitos e osteoblastos. Esta proteína encontra-se presente noutros locais do corpo humano, existindo dois transcritos variantes: CRTAC1-A (presente na cartilagem e pulmões) e CRTAC1-B (presente no cérebro, olho, cristalino do olho e na glândula pineal). Esta proteína tem um peso molecular de 68 kDa e é constituída por 661 aminoácidos, incluindo um péptido de sinal de 27 aminoácidos, localizado na zona N-terminal. É constituída por vários domínios, dos quais: um domínio integrina N-terminal, que contém quatro motivos FG-GAP; seguido de um domínio ASPIC/UnbV; e um domínio EGF (do inglês, epidermal growth factor) C-terminal. Encontra-se ainda ao longo da sua sequência proteica um motivo RDG. Os motivos FG-GAP (FG, motivo conservado fenilalanina-glicina; GAP, motivo conservado glicina-alanina-prolina) são encontrados na zona N-terminal de α e β integrinas, uma família de proteínas que medeia a interação célula-célula e célula- matriz extracelular. Os motivos tripeptídicos RGD (motivo conservado arginina-glicina-ácido aspartático), em comum com os motivos FG-GAP, estão presentes em muitas integrinas e ligantes de integrina. O domínio ASPIC/UnbV encontra-se também associado a interações célula a célula e célula a matriz extracelular. A presença dos motivos FG-GAP 3 e 4, tal como o domínio EGF e a natureza acídica da proteína, são responsáveis pela sua capacidade de se ligar a catiões divalentes como o cálcio. A CRTAC1 foi inicialmente patenteada como biomarcador de fratura óssea e lesão da cartilagem e, numa segunda patente, como biomarcador e alvo terapêutico de várias doenças, tais como: problemas cardiovasculares, hematológicos, gastrointestinal, urológicos, doenças respiratórias, problemas inflamatórios, distúrbios neurológicos e vários tipos de cancro. A CRTAC1-B é um antagonista endógeno dos receptores Nogo-1, cuja neutralização está associada à regeneração axonal após a lesão, e pacientes que sofrem de esclerose múltipla (uma desordem desmielinizante auto-imune do sistema nervoso central, causada pelo acúmulo de moncócitos nesses locais) revelam uma presença incomum desta proteína no líquido cefalorraquidiano. Contudo, ainda não é conhecida a função destas proteínas nem o seu papel no desenvolvimento destas patologias. A análise filogenética, com proteínas de diversas espécies, revelou que estas proteínas são ancestrais, uma vez que se encontram presentes deste as cianobactérias até aos vertebrados. No ramo dos vertebrados, surge um cluster correspondente à CRTAC1 (presente em teleósteos e tetrápodes) e outro cluster (presente em teleósteos) que corresponde a uma proteína ortologa, denominada de CRTAC2, que difere pela ausência do domínio EGF C-terminal. A existência de duas formas de CRTAC em teleósteos é consistente com a hipótese de que o genoma dos peixes teleósteos foi submetido a um evento específico de duplicação total do genoma. As características altamente conservadas e sua manutenção durante os processos evolutivos sugeres que estas proteínas possuem funções vitais que são comuns pelos vários em filos. A proteína CRTAC1 dos teleósteos possui alta similaridade na sequência de aminoácidos à semelhança das regiões N-terminal e média da CRTAC1 humana (hCRTAC1), indicando que estas podem ter funções semelhantes. A CRTAC1 e CRTAC2 possuem uma distribuição tecidular generalizada de transcritos e proteínas, sendo encontrados no sistema nervoso (glândula pituitária, cérebro e espinal medula), gónadas, fígado, rim, coração, músculo e estruturas calcificadas. Estudos de hibridação in situ em pituitárias de S. auratus, demonstram uma grande quantidade de RNAm de CRTAC2 em pequenas células de forma irregular com grandes núcleos adjacentes ao tecido neurohipofisários, entre os lóbulos anterior e posterior. A libertação de CRTAC2 a partir da glândula pituitária de S. auratus pode sugerir que esta proteína, para além de ser uma proteína de matriz extracelular, pode também ter também funções endócrinas. A estrutura ancestral e conservada das proteínas CRTAC indica que estas devem ter uma função importante, que ainda não foi caracterizada, sendo este o ponto de partida deste estudo. A análise por RT-PCR e Western blot demonstram que a linha celular HEK 293 expressa a proteína hCRTAC1. A localização subcelular in sílico da proteína hCRTAC1 e das proteínas de robalo (Dicentrarchus labrax, dl) CRTAC1 e CRTAC2 indicam que as CRTACs podem estar presentes nas mitocôndrias, lisossomas, aparelho de Golgi e no retículo endoplasmático. A análise por Western blot de fracções subcelulares de células HEK 293, sugere fortemente que a hCRTAC1 poderá estar presente no núcleo, retículo endoplasmático e nas mitocôndrias. O teste de exclusão de Trypan Blue com células THP-1, indica que a dlCRTAC1 tem um efeito inibidor da multiplicação celular (IC50) na concentração de 78.45ng/mL e a dlCRTAC2 a 95.50ng/mL, no entanto, não foi observada morte celular, mas sim o aumento da aderência celular. O ensaio de MTS indica que a dlCRTAC1 inibe a proliferação celular. Nos ensaios de hanging drop, a dlCRTAC1 aumenta o tamanho dos agregados de células THP-1 e a circularidade dos agregados aumenta quando incubadas com a dlCRTAC1 e a hCRTAC1. Os ensaios de wound scratch com células HEK 293, indicam que a dlCRTAC2 inibe a capacidade de cicatrização enquanto que a dlCRTAC1 e a hCRTAC1 promovem esta capacidade. No ensaio de motilidade com macrófagos, a dlCRTAC1 aumenta a motilidade celular e a dlCRTAC2 inibe a motilidade destas células. Estes resultados sugerem que as CRTACs inibem a proliferação de células THP-1, mas promovem a sua capacidades de adesão e agregação; inibem (em baixas concentrações) e promovem (em concentrações mais elevadas) a capacidade de cicatrização de culturas de células HEK 293 em monocamada; e que a dlCRTAC1 promove a motilidade dos macrófagos enquanto que a dlCRTAC2 inibe a motilidade dos mesmos.Power, DeborahAnjos, LilianaSapientiaCoelho, André da Soledade Carruna2018-07-18T00:30:13Z2016-12-1320162016-12-13T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.1/9871TID:201704773enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-24T10:21:25Zoai:sapientia.ualg.pt:10400.1/9871Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:01:41.924683Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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