Structural characterization and comparative analysis of human and piscine cartilage acidic protein (CRTAC1/CRTAC2)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Guerreiro, Marta Lúcia Amaro
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.1/8345
Resumo: Dissertação de mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014
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spelling Structural characterization and comparative analysis of human and piscine cartilage acidic protein (CRTAC1/CRTAC2)CRTACβ-sheetThermostabilityDiseasesAmyloidStructureDomínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e TecnologiasDissertação de mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014CRTAC (Cartilage Acidic Protein) firstly identified as a chondrocyte marker in humans and implicated in a number of diseases. This ancient protein is present from prokaryotes to vertebrates and the teleost are the only group that contain duplicates (CRTAC1/CRTAC2). The structure of CRTACs is poorly characterized and was the starting point of the present study. To establish the molecular and structural characterization of CRTAC, three recombinant proteins [human (h) CRTAC1 and sea bass (Dicentrarchus labrax, dl) CRTAC1 and CRTAC2] were over-expressed in E.coli as inclusion bodies and their identity was confirmed by mass spectrometry. The resulting refolded recombinant proteins were obtained with a productivity of 11,51, 8,4 and 11,9 mg of protein per gram of biomass for hCRTAC1, dlCRTAC1 and dlCRTAC2 respectively and approximately 23,48%, 9,09% and 33,46% of, hCRTAC1, dlCRTAC1 and dlCRTAC2 were lost as insoluble aggregates. Size exclusion chromatography revealed the presence of mostly soluble aggregated forms of piscine CRTACs and a mixture of aggregates and monomeric form for hCRTAC1. Spectroscopic studies of human CRTAC1 and sea bass CRTAC1/CRTAC2 showed that all proteins possess secondary and tertiary structure and are particularly rich in β- pleated sheet structure (≈40%), have ≈10,3% alpha-helix and the remainder is disordered. The thermal stability of CRTAC´s structure was assessed considering heating (from 20-90ºC) and freezing (-80ºC). CRTACs retain their native secondary and tertiary structures upon heating, however a slight loss of structure was observed for hCRTAC1 at 60ºC. Freezing induced loss of secondary structure and conformational changes more pronounced for hCRTAC1 and third cycle of dlCRTAC2 and less perceptible for dlCRTAC1. Amyloid formation by CRTACs was assessed in Thioflavin-T assays and a decrease in fluorescence was observed after incubation. In summary, CRTAC´s have propensity to form soluble aggregates that are highly thermostable and these structural properties are conserved from teleosts to humans.A CRTAC (proteína acídica da cartilagem) é uma proteína da matriz extracelular, inicialmente identificada em humanos como marcador de condrócitos e que está também associada a várias doenças, como a esclerose múltipla. Esta proteína ancestral está presente desde os procariotas até aos vertebrados e os teleósteos são o único grupo que contém o gene duplicado (CRTAC1/CRTAC2). Ambas as proteínas apresentam estrutura similar e possuem na região N-terminal um domínio semelhante ao das cadeias α presente nas integrinas, mas diferem na região C-terminal pelo facto da CRTAC1 ter um domínio adicional descrito como um factor de crescimento epidérmico com ligação a iões Ca2+ . A estrutura conservada das CRTAC indica que estas proteínas podem ter uma função importante que ainda não foi identificada e o facto da sua estrutura estar pouco caracterizada foi o objecto deste estudo. Para o estudo de caracterização molecular e estrutural das CRTAC, três proteínas recombinantes [hCRTAC1 humana e CRTAC1 e 2 de robalo (Dicentrarchus labrax ,dl)] foram sobrexpressas como corpos de inclusão em E.coli e a sua identidade foi confirmada por espectroscopia de massa. Após a solubilização, a purificação e o “refolding”, a produtividade das proteínas recombinantes resultantes foi de, 11,89 para a hCRTAC1, 8,4 para a dlCRTAC1 e 11,9 para a dlCRTAC2, expressa em mg de proteína obtida por g de biomassa. Durante este processo, foram registadas perdas proteicas na forma de agregados insolúveis de aproximadamente 23,48% de hCRTAC1, 9,09% de dlCRTAC1 e 33,46% de dlCRTAC2. Análises de cromatografia de exclusão molecular, das proteínas CRTAC solubilizadas, revelaram a presença de agregados de elevado peso molecular da dlCRTAC1 e 2 de peixes e uma mistura de agregados e monómero da CRTAC1 humana. Os estudos espectroscópicos, demonstraram que, as proteínas recombinantes CRTAC têm estrutura secundária e terciária e que a sua estrutura secundária é particularmente rica em folha-β (≈40%), tendo apenas 10,3% de hélice-α e a restante estrutura é desordenada. Neste estudo foi avaliada a estabilidade térmica da estrutura das CRTAC, considerando o efeito do aquecimento (de 20º a 90ºC) e do congelamento em vários ciclos (-80ºC). Os resultados indicaram que, as CRTAC mantêm a sua estrutura secundária e terciária após o aquecimento, no entanto, no caso da CRTAC1 humana foi observada uma ligeira perda de estrutura a partir dos 60ºC. O efeito do congelamento induziu a uma perda de estrutura secundária e também a alterações conformacionais mais evidentes na CRTAC1 humana relativamente á dlCRTAC1 e dlCRTAC2 de peixes. A capacidade de formação de fibrilas amilóides pelas CRTAC, sob certas condições de incubação, foi avaliada utilizando ensaios com Tioflavina-T. Após a incubação foi observada uma diminuição da fluorescência e estes resultados sugerem que, as CRTAC´s podem facilmente formar agregados de grandes dimensões com propriedades não-amilóides que, podem ser degradados ou sair de solução após longos periodos de incubação. Admite-se a hipótese de que tais agregados possam ser estruturas funcionais. Resumindo, as proteínas CRTAC tendem a formar agregados solúveis que são altamente termoestáveis e estas propriedades estruturais são conservadas desde os teleósteos até aos humanosPower, DeborahAnjos, LilianaMorgado, IsabelSapientiaGuerreiro, Marta Lúcia Amaro2016-05-27T09:04:50Z201420142014-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.1/8345TID:201978075enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-24T10:19:36Zoai:sapientia.ualg.pt:10400.1/8345Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:00:32.144728Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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