Effectiveness of hyaluronidase on degrading hyaluronic acid

• Autor(a) principal: Oliveira, Joana Rita Ferreira de
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/61584
• topic: Teses de mestrado - 2023; Saúde Oral; Medicina Dentária

O ácido hialurónico é um glicosaminoglicano com capacidade de absorção de água, cuja utilização tem sido cada vez mais frequente em fillers injetáveis, de modo a melhorar as características estéticas da face. Com o crescente aumento da popularidade e utilização de fillers de ácido hialurónico na medicina estética, surgiu a necessidade de encontrar um antídoto eficaz para tratar possíveis complicações relacionadas com estes procedimentos, como por exemplo oclusões vasculares ou reações alérgicas. Neste contexto, a hialuronidase, uma enzima com capacidade de degradar o ácido hialurónico em ácido glucorónico e N-acetilglucosamina (NAG), tem sido amplamente utilizada. Esta enzima tem sido objeto de estudo crescente desde a primeira metade do século XX. Para além do seu uso na medicina estética, embora ainda off- label, é utilizado em diversas outras áreas da medicina. Em 1971, esta enzima foi bem documentada e classificada por Karl Meyer em três origens distintas: animal, microbiana e de moluscos, com base não só na sua estrutura como também na sua atividade enzimática. Após vários estudos, foi desenvolvida uma enzima com maior atividade, criada por engenharia recombinante, com recurso ao DNA de hamsters. Atualmente, as formulações mais frequentemente utilizadas na prática clínica são de origem animal e de origem recombinante. Apesar da importância da hialuronidase no contexto dos fillers de ácido hialurónico, existe uma escassez de estudos na literatura relativamente a este tema, nomeadamente na comparação da efetividade de hialuronidases de diferentes origens na degradação de ácido hialurónico. Além disso, a influência que as propriedades físicas dos fillers podem ter nesta degradação também necessita de maior investigação, apesar de ser um tema já mais desenvolvido. Não existe consenso no que diz respeito às concentrações de enzima a utilizar, sendo premente uma padronização para facilitar a aplicabilidade clínica destas enzimas. Com base nestas limitações, foi identificada a necessidade de realizar um estudo que comparasse a efetividade de duas hialuronidases de diferentes origens na degradação de fillers injetáveis de ácido hialurónico, tendo sido esse o objetivo do estudo experimental apresentado. Para a realização do estudo experimental, foram utilizados dois fillers de ácido hialurónico da marca Fillmed® (França) e duas hialuronidases distintas, uma animal da marca InstitutoBcn® (Espanha) e outra recombinante da pbserum® (Espanha), formando assim quatro grupos de estudo: ART FILLER® Universal com hialuronidase animal, ART FILLER® Universal com hialuronidase recombinante, ART FILLER® Volume com hialuronidase animal e ART FILLER® Volume com hialuronidase recombinante. A seleção de fillers e hialuronidases para este estudo baseou-se no que é frequentemente utilizado em Portugal e nas opções às quais tínhamos acesso mais facilmente. A marca Fillmed® é apresentada em poucos estudos na literatura, daí haver uma necessidade acrescida do seu estudo. A nível de hialuronidases, optou- se por utilizar uma hialuronidase de origem animal devido ao extenso histórico de estudos a que esta já foi submetida ao longo dos anos, e uma hialuronidase de origem recombinante, por ser uma formulação mais recente e com boas propriedades já documentadas na literatura. A concentração utilizada de cada hialuronidase foi de 75 UI (Unidades Internacionais) para cada 0,1ml de cada filler (25mg/ml), o que vai de encontro à literatura previamente estudada, dentro das limitações que esta apresenta. Para chegar a esta concentração, ambas as hialuronidases foram diluídas em solução salina. A cada grupo foi adicionado um reagente, p- dimetilaminobenzaldeído, também conhecido como reagente de Ehrlich, que tem a capacidade de reagir com as cadeias de NAG, libertadas pelo ácido hialurónico aquando da sua degradação por hialuronidase, fornecendo uma cor violeta à amostra. Utilizando uma técnica colorimétrica, a quantidade de NAG libertada foi posteriormente medida através da absorbância (A) com recurso a um medidor de placas (Perkin Elmer® Inc., USA). Quanto maior a degradação do ácido hialurónico, mais cadeias de NAG livres, e assim, maior será o valor de absorbância, uma vez que haverá uma cor mais intensa do reagente. Esta medição da absorbância foi realizada em quatro momentos distintos ao longo do tempo: após 1, 6, 24 e 48 horas de incubação a 37ºC, de modo mimetizar as condições de temperatura no corpo humano, com N=5. Os resultados de absorbância foram apresentados sobre a forma de média ± desvio padrão (DP) e posteriormente analisados recorrendo a um teste não-paramétrico, após se mostrar a ausência de normalidade da amostra, através de um software específico de análise estatística. H0: não existem diferenças na degradação dos dois fillers pelas duas hialuronidases. A utilização rigorosa deste protocolo experimental permitiu chegar a resultados significativos, onde se demonstrou que ambos os fillers sofreram degradação enzimática por ambas as hialuronidases (animal e recombinante). Após a análise estatística dos resultados, com recurso a um teste não-paramétrico, a hipótese nula foi rejeitada, provando que existem diferenças estatisticamente significativas na degradação dos fillers pelas duas hialuronidases. No entanto, ao realizar uma comparação das duas hialuronidases individualmente na degradação de cada filler, compreendeu-se que só se verificaram diferenças estatisticamente significativas na degradação de ART FILLER® Universal pelas hialuronidases às 24 horas (p=0,007), tempo no qual a hialuronidase recombinante se mostrou mais efetiva em comparação com a animal. No entanto, ao analisar o comportamento de ART FILLER® Volume ao longo do tempo, constatamos uma degradação estatisticamente significativa maior pela hialuronidase recombinante às 6 horas (p<0,001), 24 horas (p=0,007) e 48 horas (p<0,001) quando comparado com a hialuronidase animal. Estes dados mostram que a hialuronidase recombinante apresenta maior degradação de ART FILLER® Volume logo depois das 6h. Ao realizar a comparação individual dos dois fillers, quando submetidos à mesma hialuronidase, apenas se observaram diferenças estatisticamente significativas à 1h, na degradação destes por hialuronidase animal (p<0,001), onde se observou uma maior degradação de ART FILLER® Universal. A nível de degradação pela hialuronidase recombinante, não foram demonstradas diferenças entre os fillers. Assim, observou-se que não existem diferenças significativas no filler em si que possam influenciar a sua degradação, quando comparado com o outro filler em análise, após 6h de incubação. Com base nos resultados obtidos, o nosso estudo permitiu concluir que, entre todos os grupos analisados, a hialuronidase que apresenta melhores resultados ao longo do tempo é a recombinante, principalmente na degradação de ART FILLER® Volume, enquanto ART FILLER® Universal não mostrou diferenças significativas na sua degradação pelas duas enzimas na maioria dos tempos medidos. Também se observou que não há diferenças na degradação dos dois fillers diferentes quando submetidos à mesma hialuronidase, nem quando submetidos à de origem animal nem à de origem recombinante, a partir das 6h de incubação. O estudo realizado contribui para a evolução do conhecimento e da literatura existente, porém, é importante destacar que existiram diversas limitações que podem ser superadas com a formulação de estudos futuros na área. Entre essas limitações encontram-se a falta de recursos, o que impossibilitou a realização de medições mais frequentes ao longo do tempo, para uma melhor compreensão do comportamento da enzima e da sua interação com o ácido hialurónico. Para além disso, tratando-se de um estudo in vitro há sempre condições que são difíceis de mimetizar e deve-se ter isso em consideração ao extrapolar os resultados deste estudo para a prática clínica. Muitos dos estudos presentes na literatura utilizam concentrações de hialuronidase muito elevadas, que dificilmente são extrapoladas para a prática clínica sem nenhum risco acrescido. Sugerimos que futuras pesquisas avaliem não só as duas hialuronidases mencionadas neste estudo como também analisem o seu comportamento ao longo de um maior período de tempo e com diferentes concentrações.