Immunogenicity and tumour microenvironment in the zebrafish xenograft model

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gil, Mariana Maia
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/31563
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
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spelling Immunogenicity and tumour microenvironment in the zebrafish xenograft modelCancro colo-rectalXenotransplantesPeixe-zebraMicroambiente tumoralTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A incidência e a prevalência do cancro têm vindo a aumentar, sendo que, actualmente, o cancro representa uma das maiores causas de morte a nível mundial. As terapêuticas para esta doença focam-se nos diferentes “hallmarks of cancer”, isto é, actuam sobre características biológicas particulares às células tumorais. Dentro destas, o microambiente tumoral tem ganho relevo, com um foco maior nas células do sistema imunitário que o compõem. Embora as células imunitárias sejam um dos principais constituintes dos TME, a resposta imunitária anti-cancro encontra-se muitas vezes suprimida. Deste modo, as imunoterapias actuam não sobre as células tumorais per se, mas visam atenuar a resposta imunitária, para combater o cancro. As interacções entre as células do sistema imunitário e as células tumorais são dinâmicas e preponderantes à progressão tumoral. O sistema imunitário reconhece e elimina frequentemente células cancerígenas. No entanto, algumas subpopulações tumorais não são reconhecidas/eliminadas pelo sistema imune, permanecendo no tecido. Isto pode levar à formação de tumores pouco imunogénicos, isto é, que não induzem uma resposta imunitária. Advém a ideia de que, resultante da acção do sistema imunitário, os tumores são seleccionados relativamente à sua imunogenicidade. Entre outras, as experiências de Schreiber et al. tiveram como objectivo perceber o efeito do sistema imunitário no desenvolvimento e na progressão tumoral. Para tal, carcinogénicos químicos foram injectados em ratos imunocompetentes (WT) e em ratos imunodeficientes (Rag2-/-). Os autores observaram que a taxa de formação de tumores em ratos imunocompetentes foi muito baixa, o que contrastou com uma maior eficiência em ratos imunodeficientes. Estes resultados sugerem que o sistema imune previne a formação de tumores, processo denominado por “immune surveillance”. Numa experiência consequente, os tumores que cresceram em ratos WT e em ratos Rag2-/- foram injectados em ratos imunocompetentes (WT). Curiosamente, os poucos tumores provenientes de ratos WT (que já tinham sido seleccionados relativamente à sua imunogenicidade, “editados”) conseguiram implantar com maior eficiência em ratos com o sistema imunitário competente (100% de implantação). No entanto, os tumores provenientes de ratos Rag2-/- (que ainda não foram sujeitos à pressão selectiva do sistema imunitário, “não editados”) não foram tão eficientes a implantar quando sujeitos à acção do sistema imunitário (50% de implantação). Esta experiência sugere que a interacção entre as células do sistema imunitário e as células tumorais é crucial à progressão tumoral num hospedeiro imuno competente. Para além disto, estas experiências sugerem ainda que o estudo da capacidade de implantação de diferentes tumores poderá ajudar a perceber o papel do sistema imunitário na progressão tumoral. Recentemente o peixe-zebra demonstrou ser um bom modelo para xenotransplantar tumores humanos, mostrando ter resolução suficiente para diferenciar a capacidade de implantação de linhas tumorais derivadas do mesmo paciente. Diversos trabalhos em peixes-zebra têm demonstrado a sua eficiência para estudar a interacção de células tumorais com células do sistema imunitário através de microscopia em tempo real. Em estudos anteriores do laboratório, duas linhas celulares de cancro colo-rectal provenientes do mesmo paciente foram injectadas em larvas de peixe-zebra. Enquanto as células SW480 (que derivaram do tumor primário) são frequentemente rejeitadas do hospedeiro, as SW620 (que derivaram de uma metástase nos gânglios linfáticos) têm uma grande capacidade de implantação. O MIX (co-injecção de SW480+SW620, num rácio de 1:1) apresenta uma capacidade de implantação intermédia entre as SW480 e as SW620. Observou-se também que, no MIX, a capacidade de proliferação das SW480 aumenta e a apoptose das células SW620 diminui, sugerindo que estas células estabelecem uma interacção de cooperação in vivo. Para além da capacidade de implantação das SW480 aumentar quando estas são co-injectadas com as SW620 (“MIX”), esta também aumenta quando as SW480 são injectadas em larvas de peixes- zebra nas quais o desenvolvimento do sistema imunitário inato foi comprometido (após injecção de Pu.1 morfolino). Estes resultados sugerem que a linha celular SW620 poderá ter um papel imunossupressor que lhe confere a capacidade de implantação. Consequentemente, o grande objectivo deste trabalho é perceber “Qual é o mecanismo responsável pelo processo de implantação/rejeição?”. Para estudar a interacção entre as SW480, as SW620 e o peixe-zebra, foi primeiro testado se as interacções de cooperação entre estas células (aumento de proliferação e diminuição de apoptose) são um resultado de propriedades intrínsecas dos tumores (tumour-autonomous), ou se dependem do hospedeiro (non-tumour-autonomous). Como tal, as células SW480 e SW620 foram mono- e co-cultivadas in vitro. Se a cooperação observada fosse resultado de propriedades intrínsecas dos tumores, então o mesmo fenótipo de proliferação e apoptose em co-cultura in vitro deveria ser observado. Contudo, não foram observadas diferenças nos comportamentos das células entre mono- e co-cultura, sugerindo que a cooperação observada in vivo é dependente do hospedeiro. Os resultados de cooperação obtidos relativamente à proliferação e à apoptose são referentes a tumores implantados, no final do ensaio. Como a diminuição da implantação tumoral é um processo dinâmico e contínuo, para perceber os mecanismos envolvidos na implantação/rejeição é necessário analisar estas características num time-point inicial e ao longo do tempo. No entanto, as diferenças observadas tanto ao nível de proliferação como de apoptose não explicam as diferentes capacidades de implantação/rejeição. O facto da capacidade de implantação das SW480 aumentar na ausência do sistema imunitário inato sugere que a capacidade de implantação/rejeição pode ser mediada por neutrófilos e/ou macrófagos, uma vez que são as células mais abundantes do sistema imunitário neste estadio de desenvolvimento do peixe. Para caracterizar a interacção entre as linhas celulares SW480 e SW620 com o sistema imunitário inato, estas linhas tumorais foram injectadas em peixes-zebra transgénicos, com os neutrófilos ou os macrófagos a expressar marcadores fluorescentes, permitindo a sua quantificação no microambiente tumoral. Os resultados indicam que o microambiente tumoral das SW620 é composto por uma maior percentagem de macrófagos comparativamente à de neutrófilos. Em contraste, o microambiente tumoral das SW480 apresenta mais neutrófilos do que o das SW620. Curiosamente, o microambiente tumoral do MIX apresenta valores intermédios, sugerindo que as subpopulações tumorais podem ter sinais contrários. Apesar de o número de neutrófilos não parecer estar associado com a rejeição, verificou-se um aumento destas células no microambiente tumoral das SW620 durante o processo de implantação, sugerindo uma possível função pro-tumoral dos neutrófilos em resposta à metástase. Para além disto, enquanto o número de neutrófilos é independente do número total de células SW480, é dependente do número de células SW620, apontando para diferentes comportamentos dos neutrófilos em resposta às duas subpopulações. Durante o processo de “tumour immunoediting” há uma selecção que leva à progressão de tumores pouco imunogénicos. Estes tumores “editados” conseguem escapar ao controlo do sistema imunitário, tendo uma maior capacidade de implantação em hospedeiros imunocompententes. Considerando esta premissa, os resultados de implantação deste trabalho permitem associar as condições SW480-MIX-SW620 como três estados consecutivos de progressão tumoral, que podem representar uma história de evolução clonal. Durante a progressão tumoral, o tumor primário, SW480, que apresenta uma baixa implantação, poderá ter adquirido uma nova subpopulação, as SW620. A co-existência das duas subpopulações é representada pelo “MIX” que tem uma capacidade de implantação intermédia. A subpopulação SW620 terá posteriormente adquirido a capacidade de metastizar, apresentando a maior capacidade de implantação e, como tal, o maior “fitness”. Esta subpopulação parece ter a capacidade de escapar ao controlo do sistema imunitário. Este trabalho mostra diferenças quantitativas relativamente à população de neutrófilos no TME, sugerindo que os neutrófilos possam ter funções diferentes. Para além disto, a estratégia utilizada permite inferir mecanismos imunitários associados à progressão tumoral. Deste modo, o sistema imunitário inato pode ser um novo alvo complementar às actuais imunoterapias focadas apenas no sistema imune adaptativo. Uma vez que a implantação de tumores humanos em peixes-zebra parece ser mediada por neutrófilos e macrófagos, ao modular estas populações no peixe zebra poder-se-á melhorar a eficácia da implantação de xenotrasplantes de tumores humanos neste modelo animal. Como esta técnica visa ser usada para discriminar qual a quimioterapêutica mais eficiente para cada paciente, aumentar as taxas de sucesso desta técnica poderá contribuir para uma melhor eficiência da medicina personalizada.Cancer develops through a dynamic cross-talk between tumour and immune cells. Within an heterogenous tumour, while the more immunogenic tumour subpopulations may be cleared, the subpopulations less recognised by the immune system or that create an immunosuppressive microenvironment may remain in the host. These subpopulations can evade immunity, leading to the progression of a low immunogenic tumour. Preliminary data from our laboratory showed that two colorectal cancer cell lines derived from the same patient have contrasting capacities to engraft in the zebrafish larvae. The poor engraftment of SW480 (primary-tumour-derived) is enhanced in the presence of SW620 (lymph-node metastasis-derived) which implant efficiently. Interestingly, when co-injected, these tumour subclones establish an in vivo cooperative interaction, where SW480 proliferation increases and SW620 apoptosis reduces. The engraftment of SW480 is also increased when the myeloid cellular compartment of the zebrafish larvae is genetically suppressed. These exciting results drive the main question of this thesis “What is the mechanism behind implantation/rejection capacity?” and prompted us to study the interactions between SW480, SW620 and the host innate immunity. After confirming the previous preliminary data, we asked whether the observed cooperative interaction regarding proliferation and apoptosis was tumour-autonomous or host dependent. To test this SW480 and SW620 were mono or co-cultured in vitro. However, the cooperative effect was no longer observed in vitro, suggesting that cooperation is host dependent and therefore we focused on studying the in vivo interactions. We started by analysing engraftment/rejection along time and observed different dynamics between conditions from the first moments in vivo. Thus, to understand the mechanisms behind it, we analysed xenografts at different time-points including tumours that will engraft and that will be host-rejected. Our results suggested that neither proliferation nor apoptosis are able to modulate engraftment and therefore, the next step was to characterise the neutrophil and macrophage populations in the tumour microenvironment (TME). For this, SW480, SW620 and MIX were injected in transgenic zebrafish with these specific myeloid cells fluorescently labelled. We found that the TME of SW480 has a higher percentage of neutrophils when compared to the TME of SW620. At 1day post-injection (dpi), the MIX TME presents an intermediate percentage of neutrophils, suggesting that SW480 and SW620 may generate conflicting signals regarding neutrophil recruitment. Moreover, only regarding SW620, it was observed that the number of neutrophils in the TME increases along time and is dependent on the number of tumour cells. Concluding, these results suggest that, not only SW480 rejection is independent of neutrophil numbers, but also that neutrophils may acquire a different function in response to SW620, with a possible pro-tumoural effect favouring engraftment. The tumour-immunoediting process drives the progression of a low immunogenic tumour, which parallels Darwinian evolution. These “edited” tumours can evade the immune system, being able to engraft in immunocompetent hosts. Following, tumour engraftment rates may be a surrogate of tumour’s immunogenicity and thus of tumour progression, meaning that engraftment capacity may be a proxy of tumour fitness. Under this hypothesis, our engraftment results suggest that the SW620 subpopulation appeared in the SW480 primary tumour and further derived metastisation. Understanding these intricate interactions between tumour subclones and innate immunity may lead to new avenues of anti-cancer therapies targeting the innate immune component, complementing current adaptive immunotherapies. In contrast, if neutrophils and macrophages play a role in implantation success, modulation of these cells may improve implantation rates of zebrafish patient derived xenografts (zPDXs) as a screening platform for precision medicine.Fior, Rita,1977-Rodrigues, Maria Gabriela,1965-Repositório da Universidade de LisboaGil, Mariana Maia2018-02-07T15:27:22Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/31563TID:201872404enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:25:14Zoai:repositorio.ul.pt:10451/31563Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:47:01.847579Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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