Identification of de-regulated circulating microRNAs as putative biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Elias, Nuno Diogo Peixinho
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/61396
Resumo: Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2023
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spelling Identification of de-regulated circulating microRNAs as putative biomarkers in amyotrophic lateral sclerosisEsclerose Lateral Amiotrófica (ELA)MicroRNAsBiomarcadoresDysregulationLongitudinal analysisTeses de mestrado - 2023Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2023A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa heterogénea, progressiva e fatal, caracterizada pela degeneração dos primeiro e segundo neurónios motores, causando atrofia muscular, paresia e, mesmo, morte após 2 a 5 anos do início dos sintomas. O nome foi cunhado por Jean-Martin Charcot, no século XIX, e reflete a degeneração dos neurónios motores corticospinais (esclerose lateral) e a atrofia muscular secundária devido ao desaparecimento dos neurónios motores medulares. Não há tratamento eficaz para a ELA e o diagnóstico é um exercício clínico apoiado por estudos neurofisiológicos e de neuroimagem. Os atrasos no diagnóstico são um enorme desafio na gestão da doença e o diagnóstico precoce é crucial para uma gestão clínica eficaz. Estes atrasos no diagnóstico, que possivelmente vão além da janela de oportunidade terapêutica, combinados com a heterogeneidade clínica e a complexidade destas doenças trazem a necessidade de um biomarcador de diagnóstico e prognóstico. A identificação de um biomarcador fiável permite um diagnóstico mais precoce e, portanto, uma entrada mais precoce em ensaios clínicos, aproximando-nos assim do objetivo de encontrar um agente farmacológico capaz de travar a degeneração dos neurónios motores. O biomarcador ideal deve exibir alta sensibilidade e especificidade para distinguir a ELA de outras doenças neurológicas, e para monitorizar a progressão da doença. A procura de biomarcadores relacionados com a ELA tem sido predominantemente realizada utilizando o líquido cefalorraquidiano (LCR), devido à sua relação próxima com o Sistema Nervoso Central (SNC). Embora o LCR represente uma fonte importante de biomarcadores, não é adequado para screening de primeira linha e para estudos repetidos ao longo da progressão da doença. Devem ser feitos esforços para tentar identificar biomarcadores sensíveis e especificos no sangue, pois é fácil de obter e manusear, permite múltiplos testes a baixo custo, e é o procedimento menos invasivo. Uma classe de moléculas que tem sido cada vez mais investigada como potenciais biomarcadores para ELA são os microRNAs (miRNAs). Os miRNAs são RNAs não codificantes de 20 a 25 nucleótidos, evolutivamente conservados, e que regulam os processos biológicos em organismos eucarióticos através da clivagem ou repressão translacional dos RNAs mensageiros (mRNA), modulando, assim, vários processos fisiológicos. Para mais, várias proteínas relacionadas com ALS (tais como TDP-43 e FUS) estão envolvidas na biogénese dos miRNAs. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar um conjunto de miRNAs no plasma sanguíneo de pacientes com ELA, que possuíam o potencial para ser possíveis biomarcadores de diagnóstico e prognóstico. Identification of de-regulated circulating microRNAs as putative biomarkers in Amyotrophic Lateral Sclerosis Para atingir o objetivo, utilizámos amostras de plasma sanguíneo de três grupos diferentes, nomeadamente, doentes com ELA (35), doentes com outras doenças que mimetizam a ELA (16) e controlos saudáveis (15). Num projeto anterior identificámos 10 miRNAs desregulados em amostras de plasma combinadas de pacientes com ELA. No estudo atual comparámos a expressão relativa destes miRNAs em amostras individuais de plasma entre os 3 grupos. Tendo em conta que 16 dos nossos 35 doentes com ALS possuíam 3 colheitas de sangue distintas e separadas no tempo, também realizámos uma análise longitudinal. Comparamos as amostras dos 16 doentes entre as 3 diferentes colheitas. O RNA total em cada amostra foi purificado de acordo com o protocolo miRNeasy® Serum/ Plasma Advanced Kit (QIAGEN). Um PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) com kits de ensaio TaqMan miRNA (ABI) foi utilizado para quantificar a expressão miRNAs. Os resultados foram analisados por software aconselhado pelo fabricante e combinados com um conjunto de dados clínicos que permitiu o agrupamento dos doentes em diferentes subgrupos: sítio de início da doença (medular ou bulbar), neurónio motor predominante (superior ou inferior), velocidade de progressão (lenta ou médio/rápida), capacidade vital forçada (normal ou anormal) e género (feminino ou masculino). Também foi realizada uma análise de enriquecimento para uma melhor compreensão da ação dos miRNAs menos associados à ELA. As comparações de expressão relativa de miRNAs entre as amostras dos três grupos revelaram que apenas o hsa-miR-7-2-3p apresentava diferenças significativas de expressão entre grupos (entre doentes ELA e doentes com doenças que mimetizam ELA). Este miRNA não se expressou de todo em nenhuma das amostras do grupo de doentes com perturbações que mimetizam a ELA. Quando introduzimos os dados clínicos dos doentes, e os separamos consoante os mesmos, o hsa-miR-7-2-3p também se encontrou diferentemente expresso entre o subgrupo de pacientes ELA com início medular quando comparado com o subgrupo de início bulbar. Estes resultados combinados com a nossa análise de enriquecimento apontam para um possível papel protetor deste miRNA na doença. Na análise longitudinal apenas o hsa-miR-224-5p obteve diferenças significativas em termos de expressão relativa entre colheitas (entre a 2.ª e a 3.ª). Este miRNA também apresenta diferenças significativas na sua expressão entre o subgrupo de progressão de doença lenta e o subgrupo de progressão de doença média/rápida. A análise de enriquecimento demonstrou o envolvimento deste miRNA em várias vias afetadas na ELA, contudo, e tendo em consideração todos os resultados obtidos, o hsa-miR-224-5p não revelou ter potencial como biomarcador. Tal como o hsa-miR-224-5p, o hsa-miR-26a-1-3p também revela algumas diferenças significativas de expressão relativa entre alguns dos subgrupos (início medular vs início bulbar). A análise de enriquecimento revela que este miRNA está envolvido na Identification of de-regulated circulating microRNAs as putative biomarkers in Amyotrophic Lateral Sclerosis via p53 e na via de doenças de priões. Nenhum dos resultados aponta para algum tipo de potencial do hsa-miR-26a-1-3p como biomarcador. Os resultados mais positivos deste estudo foram obtidos com o hsa-miR-206, o miRNA mais promissor e mais investigado no contexto da ELA. Este miRNA intervém na regeneração de sinapses neuromusculares e na reinervação muscular, tendo um papel protetor na ELA. A hipótese proposta por alguns autores é que o hsa miR-206 tem um pico de expressão no início da doença em resposta à degeneração provocada pela mesma. Este pico de expressão atinge, eventualmente, um plateau e começa a baixar. Por este motivo, o hsa-miR-206 é visto como um bom indicador para ELA com progressão lenta. Os nossos resultados apontam para a mesma hipótese, tendo em conta que encontramos este miRNA sobre-expresso no subgrupo de início medular e no subgrupo de progressão lenta. Apesar de promissores, é preciso interpretar estes resultados com cautela. O poder preditivo do hsa-miR-206 para doentes com progressão lenta pode ser muito útil na investigação clínica, mas uma doença tão heterogénea e complexa como ELA dificilmente é explicada por apenas um miRNA. Apesar de alguns resultados promissores que apontam para novos miRNAs envolvidos na fisiopatologia da doença, bem como resultados que reforçam o papel do hsa-miR-206 na ELA, o nosso projeto não permitiu identificar nenhum miRNA com potencial de biomarcador de prognóstico ou diagnóstico de aplicabilidade clínica. Ainda assim, os miRNAs representam uma importante fonte de informação sobre diferentes vias celulares, e, em doenças complexas como a ELA, representam um alvo de estudo valioso. A falta de consenso neste campo é um dos maiores entraves ao seu desenvolvimento: estudos são realizados utilizando diferentes tecidos e metodologias. Para mais, muitos dos estudos são realizados em populações de tamanho reduzido, pondo em causa a real validade dos seus resultados. Outras variáveis, como por exemplo a ancestralidade da população estudada, também influenciam os resultados obtidos. Surge, portanto, a necessidade de ser estabelecida uma metodologia padrão para avaliar os níveis de expressão das miRNAs na ELA. Mesmo assim, será sempre imperativo ter em consideração a heterogeneidade da doença, os múltiplos fenótipos e mecanismos fisiopatológicos, a vasta gama de funções fisiológicas e vários alvos diferentes de miRNAsAmyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a heterogeneous and progressive neurodegenerative disease. Diagnostic delays are a challenge in the management of ALS, thus sensitive diagnostic and prognostic biomarkers are needed. Blood-based biomarkers, such as microRNAs (miRNAs) are ideal for first-line screening tests. We previously identified 10 dysregulated miRNAs in pooled plasma samples of ALS patients. We here verified these de-regulated miRNAs and combine these results with clinical phenotypes. A longitudinal assessment of the miRNAs signatures in ALS patients was also performed. The study population consisted of 3 groups: ALS (35), mimic disorders (16), and healthy controls (15). Total RNA in each sample was purified according to the miRNeasy® Serum/ Plasma Advanced Kit (QIAGEN) protocol. A quantitative real-time PCR (qRT-PCR) with TaqMan miRNA assay kits (ABI) was used to quantify miRNAs expression. The results were analyzed by manufacturer-advised software and combined with a set of clinical data. No significant differences in relative expression were observed between groups in 7 of the 8 miRNAs considered. Only hsa-miR-7-2-3p was overexpressed in the ALS group compared with the MD group, where it was not expressed at all. In the longitudinal analysis, only miRNA-224- 5p showed significant differences between collections. When clustering our groups using the clinical data hsa-miR-206, hsa-miR-26a-1-3p, hsa-miR-7-2-3p, and hsa-miR-224-5p were significantly dysregulated between some subgroups. An enrichment pathway analysis was performed to better understand the miRNA pathway´s interaction. Although some promising results were obtained, we should analyze them with caution. Even though hsa-miR-206 reveals predictive potential, single biomarkers cannot explain most complex diseases. Nevertheless, miRNA might shed light on ALS pathophysiology. More studies following the same standard methodology are needed to validate the real utility of miRNAs as biomarkers in ALS.Gomes, Bruno CostaCarvalho, Mamede deRepositório da Universidade de LisboaElias, Nuno Diogo Peixinho2023-12-15T14:17:10Z2023-052023-05-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/61396TID:203308638enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-11-20T18:26:03Zoai:repositorio.ul.pt:10451/61396Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-11-20T18:26:03Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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