Desenvolvimento de um procedimento laboratorial de Next Generation Sequencing para ADN de sequenciação inviável pelo método convencional de Sanger

• Autor(a) principal: Zabolotnya, Oleksandra
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/26856
• topic: Engenharia genética; Sanger; Tecnologias de Sequenciação; Next Generation Sequencing; Ion Torrent; Genetic engineering; Sequencing Technologies; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia

O aparecimento da engenharia genética contribuiu significativamente e de forma muito concreta para a manipulação do genoma de organismos vivos, levando a importantes descobertas sobre a estrutura do ácido desoxirribonucleico e da descodificação do código genético. Com base nestes avanços e estudos revolucionários posteriormente realizados, é atualmente possível a realização de estudos de sequenciação de ADN em que, com base em métodos bioquímicos se determina a ordem exata das bases nitrogenadas de uma amostra desconhecida. Um dos objetivos deste trabalho foi implementar um protocolo alternativo que permita colmatar as limitações da técnica de Sanger. Para a elaboração deste protocolo, o trabalho englobou a preparação da biblioteca de ADN, foram realizadas otimizações de processos como a fragmentação, amplificação e Size Selection. Para o processo de sequenciação, recorremos à metodologia de sequenciação de segunda geração da Ion Torrent PGM™ System por este ter a capacidade de suportar biliões de reações de sequenciação ao mesmo tempo, a fim de produzir a sequência de bases de uma amostra de interesse. Desta forma tentou-se dar resposta aos casos que não foram possíveis de sequenciar pela tecnologia tradicional de Sanger. Com o resultado deste trabalho demos conta de várias limitações mais típicos que o método de Sanger apresenta e, recorrendo à tecnologia de Next Generation Sequencing, conseguimos identificar essencialmente problemas de contaminação, amostras de ADN sem sítio específico de ligação do primer à sequência de ADN e de formação de estruturas secundárias. A implementação do protocolo para o uso do Ion Torrent PGM™ System, permitiu assim identificar e estudar as causas de difícil sequenciação de amostras de ADN inviáveis.