Functional analysis of two Prunus dulcis CBFS by overexpression in A. thaliana and analysis of seasonal expression in field plants

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gonçalves, Nuno Miguel Loureiro, 1983-
Data de Publicação: 2011
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/6394
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
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spelling Functional analysis of two Prunus dulcis CBFS by overexpression in A. thaliana and analysis of seasonal expression in field plantsÁrvores de frutoFloraçãoResistência ao frioTranscrição genéticaExpressão genéticaTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Flowering in woody perennials, in opposition to annual/biennial plants, are heavily dependent on cold acclimation, acquired during the dormancy stage of their seasonal development. The ability to endure low temperatures is essential to the chilling requirements required for dormancy break and to resume growth. In temperate fruit trees of the Rosaceae family, the blooming time is crucial for breeders, as premature anthesis exposes flowers to winter frosts thus affecting fruit production. Almond (Prunus dulcis) belongs to the Prunoideae subfamily and is a good model for studies regarding these aspects of dormancy break and blooming as it is the tree of this family that flower earlier. Its close homology to the recently sequenced genome of peach (Prunus persica) also facilitates molecular research focused on these traits, still largely based on the annual plant model Arabidopsis. In this thesis we have investigated the putative involvement of two novel almond genes in the regulation of flowering time. These genes, PrdCBF1 and PrdCBF2, are known to be regulated by low temperatures during dormancy and they belong to a large family of transcription factors known as CBF/DREB1 (C-REPEAT (CRT)/DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT (DRE)-BINDING FACTORS). They are activated during periods of low temperature induced stress and bind to CRT domains of promoters of cold-regulated (COR) genes, which provide protection against freezing damage. Functional studies were conducted through overexpression of PrdCBF1 and PrdCBF2 in Arabidopsis thaliana, to investigate protein variation and stability under several different treatments, as well as analyzing transcript accumulation of transgenes and endogenous genes involved in cold response (AtCBF1, AtXero2 and AtCOR15a (both COR genes), as well as AtRD29A) or related to the gibberellin growth-induction pathway (AtGA20ox1 and AtGA2ox3). We were able to prove that constitutively expressed PrdCBF2 activates Arabidopsis genes related to cold acclimation and provides enhanced protection against freezing damage in transgenic plants in comparison to non-acclimated plants. Some difficulties encountered when handling the transgenic lines also allowed characterization of the dwarf phenotype obtained and the growth retardation pattern induced by CBF overexpression, as well as the transgene silencing triggered by DNA methylation. Additionally, we studied PrdCBFs expression during seasonal development in field trees, and analyzed the downstream gene PrdDHN1, a COR gene that belongs to the dehydrin protein family, as well as several genes related to flowering and growth induction, such as genes encoding MADS-box proteins (PrdMADS1 and PrdMADS3) and gibberellin pathway enzymes (PrdGA20ox and PrdGA2ox). The results obtained provided evidence of the PrdCBFs upregulation during early to mid-winter periods of dormancy and cold acclimation and their downregulation relating to deacclimation after dormancy break. New putative markers (PrdMADS3, PrdGA2ox and PrdGlyc) for dormancy break and transitioning to blooming time also emerged, which may become novel players in a model of regulation of perennial dormancy. Additionally, these markers may further be applied in detection of differential blooming time cultivars in breeding programs as well as to serve as indicators of dormancy break in more mature trees.As árvores perenes, ao contrário das plantas anuais ou bienais, dependem da aclimatação ao frio adquirida durante a fase de dormência do desenvolvimento sazonal. A capacidade de resistir a temperaturas baixas é essencial para atingir os requisitos de frio da planta, ou seja, o total de horas de exposição a baixas temperaturas necessário para a quebra da dormência e a re-activação do crescimento. Em árvores de fruto de climas temperados da familia Rosaceae, o tempo de floração é crucial para os agricultores já que a ântese prematura aumenta a probabilidade de exposição à geada, o que naturalmente compromete a viabilidade das flores e a produção final do fruto. A amendoeira (Prunus dulcis), pertencente à subfamilia Prunoideae, é um bom modelo para estudos que se debruçam sobre aspectos relacionados com a quebra da dormência e com a floração, visto ser a primeira árvore fruteira desta família a florir. A homologia com o pessegueiro (Prunus persica), cujo genoma foi recentemente sequenciado, permite o desenvolvimento de estudos a nível molecular focados nestas características, até à data ainda fundamentados num modelo herbáceo e de ciclo de vida anual, a Arabidopsis. Desta forma investigamos a possível ligação entre dois genes de amendoeira e a dormência e o tempo de floração. Estes genes, PrdCBF1 e PrdCBF2 (reconhecidos pela sua regulação por baixas temperaturas), pertencem a uma vasta família de factores de transcrição conhecida como CBF/DREB1 (C-REPEAT (CRT)/DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT (DRE)-BINDING FACTORS). Estes genes são activados durante periodos de stress de frio e ligam-se a domínios CRT dos promotores de genes regulados pelo frio (COR), que protegem a planta contra danos fisiológicos relacionados com a congelação intercelular. Foram efectuados estudos funcionais pela sobrexpressão de PrdCBF1 e PrdCBF2 em Arabidopsis thaliana para investigar possíveis variações de expressão das proteínas e da sua estabilidade sob diferentes tratamentos. Também se procedeu à análise da acumulação de transcrito destes transgenes e de genes endógenos envolvidos na resposta ao frio (AtCBF1, AtXero2 e AtCOR15a - ambos genes COR, bem como o AtRD29A) ou relacionados com a via de sinalização de crescimento mediada por giberelinas (AtGA20ox1 d AtGA2ox3). Foi provado que a expressão constitutiva em Arabidopsis de PrdCBF2 activa genes relacionados com a aclimatação ao frio, os quais promovem a protecção contra os danos de congelação em plantas transgénicas comparativamente a plantas não aclimatadas. Algumas dificuldades que surgiram durante a selecção de linhas transgénicas levou também à caracterização do fenótipo anão obtido, bem como da repressão do crescimento devidos à sobrexpressão de genes CBF. Foi igualmente estudado o silenciamento de transgenes desencadeado por metilação de DNA. Simultaneamente foi feito o estudo de expressão dos PrdCBFs durante o desenvolvimento sazonal de plantas de campo. Também analizámos a expressão de PrdDHN1, um gene COR a jusante dos CBFs e pertencente à família proteica das desidrinas, assim como outros genes relacionados com a floração e indução de crescimento, tais como genes codificantes de proteínas MADS-box (PrdMADS1 e PrdMADS3) e de enzimas da via das giberelinas (PrdGA20ox and PrdGA2ox). Os resultados obtidos demonstraram um aumento de expressão dos PrdCBFs durante os períodos de dormência e aclimatação ao frio nos primeiros meses de Inverno, bem como uma diminuição após a quebra de dormência. Neste trabalho são sugeridos para os genes PrdMADS3, PrdGA2ox e PrdGlyc como novos marcadores putativos das fases de quebra de dormência e transição para a ântese para a formulação de um modelo de dormência em plantas perenes. Estes marcadores podem também ser aplicados na detecção de cultivares com diferentes tempos de floração em programas de melhoramento, bem como servir de indicadores de quebra de dormência em árvores maduras.Oliveira, Maria MargaridaTrindade, HelenaRepositório da Universidade de LisboaGonçalves, Nuno Miguel Loureiro, 1983-2012-05-30T15:36:12Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/6394enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:48:54Zoai:repositorio.ul.pt:10451/6394Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:31:32.708604Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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