Mycobacterium tuberculosis subversion of host vesicular traffic pathways
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| Data de Publicação: | 2013 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/9638 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 |
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Mycobacterium tuberculosis subversion of host vesicular traffic pathwaysTuberculoseMycobacterium tuberculosisMacrófagosSilenciamento de genesTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013A tuberculose é uma doença infecciosa que afecta principalmente o sistema respiratório e está documentada em toda a história da humanidade. Acredita-se que o seu agente etiológico, M. tuberculosis, tenha provocado mais mortes que qualquer outro patogénio humano. Apesar da melhoria nas condições de saúde pública e da evolução a nível de prevenção, diagnóstico e terapêutica, são registados anualmente cerca de 9 milhões de novos casos de tuberculose e aproximadamente 2 milhões de mortes, sendo considerada a principal causa de morte a nível mundial provocada por um agente bacteriano infeccioso. O crescente aumento de co-infecções com o vírus da imunodeficiência humana (VIH) e a emergência de estirpes resistentes a antimicobacterianos têm tornado a infecção ainda mais alarmante. Isto porque a vacina disponível é ineficaz em adultos e a única terapia se baseia na administração prolongada de antibióticos. Facilmente se depreende a necessidade de desenvolvimento de novas estratégias de combate à tuberculose, sendo imperativo o estudo científico da interacção de micobactérias com o seu hospedeiro humano para melhor compreender a sua patogenicidade e descobrir novos alvos terapêuticos. M. tuberculosis é um microrganismo intracelular facultativo de crescimento lento, que possui factores de virulência únicos, incluindo componentes do envelope celular, proteínas necessárias à aquisição de nutrientes e proteínas envolvidas na subversão das respostas imunitárias inatas e adaptativas do hospedeiro. Uma das características da infecção com M. tuberculosis é a sua capacidade de sobreviver no interior de macrófagos alveolares humanos. De entre os vários factores de virulência, considera-se que a inibição da fusão do fagossoma com o lisossoma é a chave para o seu sucesso como patogénio intracelular. O bloqueio da maturação fagossomal parece ser alcançado através da interferência com factores de tráfego vesicular do hospedeiro. Nas células eucarióticas, o tráfego vesicular é regulado por proteínas SNARE (acrónimo de Soluble NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) Attachment Protein Receptor) pertencentes à maquinaria de fusão e por Rab GTPases que controlam o tráfego de vesículas e tornam específicos os eventos de fusão. Estas proteínas membranares asseguram a correcta entrega de cargas entre vesículas e organelos, sendo responsáveis pela coordenação espacial e temporal da fusão de fagossomas recém-formados com diversas vesículas. A via de transporte normal para os lisossomas inclui proteínas Rab e SNARE, na qual o organismo fagocitado é transportado de um fagossoma nascente para um compartimento endossomal precoce contendo Rab5. A reciclagem de proteínas membranares leva à perda de Rab5 e aquisição de Rab7, o que permite a maturação para fagossoma tardio antes de ser entregue ao destino final, o compartimento lisossomal. Contrariamente aos estádios de maturação anteriores, o fagolisossoma possui um pH ácido e proteases activas, que permitem a destruição e degradação de bactérias. Considerando o papel das Rabs e SNAREs na biogénese do fagolisossoma, é inequívoca a sua potencialidade como alvos de manipulação por microrganismos patogénicos intracelulares. Efectivamente, vários estudos indicam que fagossomas contendo M. tuberculosis permanecem imaturos devido à exclusão ou aquisição transiente de proteínas características de endossomas tardios, enquanto retêm proteínas que permitem manter a sua identidade como fagossomas precoces. Isto é exemplificado pelo bloqueio da transição Rab5-Rab7 em fagossomas contendo micobactérias patogénicas. Apesar dos factores de tráfego vesicular serem indicados como alvos de manipulação micobacteriana, a maioria dos estudos não esclarece o seu envolvimento na sobrevivência/morte intracelular de M. tuberculosis em macrófagos humanos. O presente trabalho teve como objectivo identificar Rab GTPases e SNAREs envolvidas na sobrevivência/morte de M. tuberculosis em macrófagos humanos THP-1, recorrendo a metodologias adequadas a ensaios em larga escala. Foi desenvolvido um método fluorimétrico com dois repórteres fluorescentes para quantificação das micobactérias intracelulares e dos macrófagos hospedeiros, uma vez que o método convencional de contagem de unidades formadoras de colónias (UFC) é não só dispendioso, mas também laborioso e inapropriado para rastreios em larga escala. Paralelamente foi produzida uma biblioteca de lentivírus a expressar short hairpin RNAs (shRNAs) específicos para silenciar os RNAs mensageiros (mRNAs) de Rab GTPases e SNAREs nas células hospedeiras. Deste modo foi possível avaliar o impacto do silenciamento de factores do hospedeiro na sobrevivência/morte intracelular de M. tuberculosis. A proteína vermelha fluorescente tdTomato foi seleccionada como repórter da sobrevivência intracelular de M. tuberculosis H37Ra. A estirpe H37Ra foi transformada com o plasmídeo pASTA3, que contém o gene para tdTomato. A transformação foi eficiente, detectando-se a presença de micobactérias fluorescentes após vários dias de crescimento em meio líquido. Os nossos resultados revelaram uma boa correlação entre fluorescência e densidade óptica, demonstrando que a fluorescência de tdTomato permite discriminar diferentes concentrações micobacterianas in vitro. Verificámos também que o método fluorimétrico permite avaliar a sobrevivência intracelular de M. tuberculosis H37Ra (tdTomato) em macrófagos THP-1 até ao terceiro dia após a infecção. De forma semelhante ao método de contagem de UFC, o método fluorimétrico permitiu distinguir entre multiplicidade de infecção (MOI) 1 e MOI 5 e apresentou o mesmo perfil de sobrevivência micobacteriana. No entanto, tendo em conta que a estirpe H37Ra só começa a multiplicar-se intracelularmente ao terceiro dia após a infecção e que a morte dos macrófagos aumenta ao sétimo dia, considerámos que o dia 5 seria o tempo de medição ideal para avaliação da sobrevivência intracelular. O método fluorimétrico não permitiu detectar a presença de micobactérias fluorescentes em células infectadas com MOI 1 ao quinto dia após a infecção, os quais correspondem à MOI e tempo de infecção pretendidos para avaliar a sobrevivência intracelular na triagem dos factores de tráfego vesicular. A quantificação micobacteriana nestes parâmetros foi possível apenas pelo método convencional de contagem de UFC, o qual optámos por manter nos nossos ensaios. Não obstante, M. tuberculosis H37Ra fluorescente pode ser útil em estudos que utilizem aparelhos mais sensíveis, destacando-se a citometria de fluxo e a microscopia de fluorescência. Nos ensaios de sobrevivência intracelular de micobactérias, geralmente desconhece-se a viabilidade dos macrófagos. Este parâmetro é de extrema importância, permitindo revelar se há, efectivamente, um decréscimo de bactérias intracelulares ou se a diminuição se deve à morte dos hospedeiros. Os nossos resultados confirmaram que a intensidade de fluorescência resultante da metabolização de alamarBlue está positivamente correlacionada com o número de macrófagos THP-1. Este método é, portanto, adequado para avaliar a viabilidade de macrófagos durante ensaios de infecção. Para compreender o papel dos factores de tráfego vesicular na infecção micobacteriana, procedemos a uma triagem preliminar usando a estirpe avirulenta M. tuberculosis H37Ra. Após o silenciamento com lentivírus e selecção com puromicina, os monócitos THP-1 foram diferenciados em macrófagos e infectados com MOI 1. O número de micobactérias intracelulares foi determinado ao dia 5 após a infecção por contagem de UFC e a viabilidade dos macrófagos foi avaliada por fluorimetria usando alamarBlue. A carga micobacteriana no interior de macrófagos THP-1 silenciados para Rab GTPases e SNAREs foi comparada com o controlo scramble (sem alvo no genoma humano). Atribuímos a designação de “hot targets” aos factores cujo silenciamento com pelo menos um shRNA resultou numa carga micobacteriana com diferenças estatisticamente significativas relativamente ao controlo. Os resultados emergentes da triagem preliminar são o produto de 3 experiências independentes, onde 13 mRNAs alvo foram individualmente silenciados nas células THP-1 com diferentes shRNAs. Apresentamos nesta tese os resultados para 5 factores, cujos níveis de silenciamento foram determinados usando a reacção de polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR). Usando esta estratégia foi possível identificar Rab7, Rab14 e Rab34 como potenciais alvos de manipulação micobacteriana, uma vez que a redução destas proteínas alterou a sobrevivência intracelular da estirpe H37Ra sem afectar a viabilidade dos macrófagos transduzidos. De entre as várias características de virulência que distinguem H37Ra de H37Rv, destaca-se a capacidade inferior da estirpe avirulenta para crescer intracelularmente. Além disso, o grau de associação de Rabs com fagossomas micobacterianos difere entre as duas estirpes. Considerando estes aspectos, os fenótipos obtidos para os potenciais alvos Rab14 e Rab34 não foram apenas confirmados, mas também comparados com a estirpe virulenta, M. tuberculosis H37Rv. Com base nos resultados de sobrevivência intracelular, demonstrámos que as duas estirpes têm diferentes capacidades de manipulação das vias de tráfego vesicular do hospedeiro. Com o intuito de revelar as implicações do silenciamento de mRNA, os níveis de Rab14 e Rab34 foram analisados ao nível da tradução. Os resultados de western blot mostraram que a transdução lentiviral diminuiu, de facto, a expressão das proteínas Rab14 e Rab34. Com o presente trabalho foi possível demonstrar que Rab7 e Rab34 são importantes para a capacidade dos macrófagos destruírem micobactérias. A diminuição destas proteínas aumentou de forma significativa a capacidade de sobrevivência intracelular de M. tuberculosis H37Ra, mas não afectou a estirpe virulenta H37Rv. Estas proteínas Rab são importantes para a função e posicionamento de lisossomas, tendo sido anteriormente indicadas como reguladores da maturação fagossomal. Efectivamente, estudos anteriores desenvolvidos em macrófagos de ratinho mostraram que Rab7 e Rab34 são recrutadas apenas transientemente para fagossomas contendo M. tuberculosis H37Rv. A sua acumulação é superior em fagossomas contendo a estirpe H37Ra, sendo ainda mais elevada quando se trata de Staphylococcus aureus. Isto significa que as duas estirpes micobacterianas interferem com a associação fagossomal de Rab7 e Rab34, embora a manipulação exercida pela estirpe H37Rv seja mais acentuada. Em concordância com a literatura, os nossos resultados indicam que H37Rv exclui Rab34 do seu fagossoma e, deste modo, o silenciamento de Rab34 não interefere com a sobrevivência intracelular. Apoiando os nossos resultados para a estirpe avirulenta, num estudo recente usando macrófagos de ratinho observou-se um aumento da sobrevivência intracelular da estirpe atenuada M. bovis BCG, face ao silenciamento de Rab34. Rab14 está envolvida no tráfego entre o complexo de Golgi e endossomas precoces, mas o seu papel na maturação fagossomal permanecia controverso. Está descrito na literatura a acumulação de Rab14 em fagossomas contendo micobactérias e que o seu silenciamento promove a biogénese do fagolisossoma. Contrariamente, nos estudos de Seto et al. (2011) a expressão de formas constitutivamente activas ou inactivas de Rab14 não interferiu com a capacidade de fusão entre fagossoma e lisossoma. Usando a nossa estratégia foi possível revelar o verdadeiro impacto da redução de Rab14 na sobrevivência de M. tuberculosis. A carga bacteriana de H37Ra diminuiu com o silenciamento de Rab14, enquanto o número de bactérias virulentas foi semelhante ao controlo. Estes resultados sugerem que Rab14 é essencial para sustentar a sobrevivência de M. tuberculosis H37Ra, contribuindo para o estabelecimento de um nicho replicativo. Contrariamente, a grande capacidade de H37Rv para sobreviver e proliferar parece ser independente da sua presença, provavelmente devido à superior habilidade para subverter os mecanismos do hospedeiro. Rab10 está envolvida na reciclagem membranar e na maturação fagossomal, regulando a transição de um fagossoma nascente para um fagossoma precoce. Verificámos que uma diminuição de aproximadamente 50% nos níveis de mRNA de Rab10 não interferiu com a sobrevivência de H37Ra em macrófagos humanos. Segundo estudos anteriores em macrófagos de ratinho, o recrutamento de Rab10 para fagossomas contendo bactérias vivas da estirpe atenuada M. bovis BCG é inferior comparando com M. bovis BCG mortas por calor. Os efeitos provocados pelo silenciamento de Rab10 parecem ser similares à exclusão de Rab10 de fagossomas contendo micobactérias vivas, o que está de acordo com os nossos resultados. À semelhança de M. bovis BCG, H37Ra parece ser também capaz de diminuir o recrutamento de Rab10 para a membrana do fagossoma, o que explica a sobrevivência inalterada face ao silenciamento de Rab10. A sintaxina 4 é uma t-SNARE (do inglês target SNARE) que se localiza nas membranas citoplasmáticas e endossomais. Um lípido micobacteriano, fosfatidil inositol manosídeo, é referido na literatura como responsável pela retenção de sintaxina 4 em membranas fagossomais. Esperávamos, portanto, que uma diminuição na expressão de sintaxina 4 limitasse a fusão entre fagossomas e endossomas, com uma consequente redução na carga micobacteriana. No entanto, um decréscimo de 30% e 50% nos níveis de mRNA de sintaxina 4 não alteraram o número de bactérias intracelulares da estirpe H37Ra. Por um lado, esta sintaxina pode ser um componente passivo durante a maturação fagossomal. Em alternativa, a retenção de outras SNAREs na membrana de fagossomas pode ser suficiente para assegurar a fusão com endossomas. Não excluindo nenhuma das hipóteses anteriormente sugeridas, é também possível que os níveis de silenciamento nas nossas experiências possam ter sido insuficientes para ter algum impacto, uma vez que não foram significativamente diferentes do controlo. Os resultados apresentados nesta tese estão em concordância com a maioria das evidências postuladas na literatura, reafirmando que M. tuberculosis exclui factores que permitem a progressão do fagossoma para fagolisossoma, tais como Rab10, Rab7 e Rab34, evitando assim a sua destruição e reconhecimento imunitário. Contrariamente, M. tuberculosis tem a capacidade de recrutar e reter nos seus fagossomas proteínas que regulam a fusão com endossomas precoces, tal como Rab14, tendo assim acesso a nutrientes e precursores biossintéticos para a sua sobrevivência.The success of Mycobacterium tuberculosis as an intracellular bacterial pathogen greatly relies in its ability to subvert the host vesicular trafficking pathways within macrophages. M. tuberculosis-containing phagosomes fail to fuse with late endosomes and lysosomes. Rab GTPases are responsible for fusion specificity and SNAREs are components of the vesicle fusion machinery. These host proteins are indicated as potential targets for mycobacterial manipulation, but their role in M. tuberculosis survival/killing in human macrophages remains unclear. In this thesis work we developed a dual fluorescent reporter method for mycobacteria and macrophage quantification. We found that intracellular M. tuberculosis expressing tdTomato, a red fluorescent protein, can be quantified in human THP-1 macrophages infected with MOI 1 by fluorescence measurement. Although the method was reliable until day 3 post-infection, did not showed to be sensitive at later times for mycobacterial quantification, in opposition to the conventional method of colony forming units counting. Macrophage viability was successfully assessed by fluorimetry with alamarBlue reagent. Using a high-throughput shRNA-based screen we identified Rab7, Rab14 and Rab34 as “hot targets” for mycobacterial manipulation and the levels of silencing were evaluated by qRT-PCR. A reduction of Rab7 and Rab34 significantly increased M. tuberculosis H37Ra survival in THP-1 macrophages, while Rab14 knockdown decreased mycobacterial burden. In contrast, no effects were observed after lentiviral silencing of Rab10 and syntaxin 4. The phenotypes obtained in the preliminary screen for Rab14 and Rab34 knockdown were successfully confirmed and compared with the virulent strain H37Rv. The levels of silencing were determined by western blot. In opposition to H37Ra, Rab14 and Rab34 depletion did not alter intracellular bacterial burden of H37Rv, indicating that differences in virulence interfere with mycobacterial competence to manipulate host vesicular trafficking.Anes, Elsa, 1964-Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-Repositório da Universidade de LisboaBugalhão, Joana Margarida Nunes, 1988-2013-12-05T17:27:19Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/9638TID:201324580enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:54:11Zoai:repositorio.ul.pt:10451/9638Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:47.325569Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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