Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis
| Autor(a) principal: | |
|---|---|
| Data de Publicação: | 2013 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/9472 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 |
| id |
RCAP_0db678a4f3af1c1126945ba2e85f4da6 |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:repositorio.ul.pt:10451/9472 |
| network_acronym_str |
RCAP |
| network_name_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository_id_str |
7160 |
| spelling |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosisMicobactériasMycobacterium tuberculosisTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013A tuberculose é uma doença infecciosa que tem acompanhado historicamente a Humanidade. Caracteriza-se tipicamente por uma infecção pulmonar, manifestando-se através de tosse persistente, febre e especialmente por uma fraqueza generalizada. Apesar da sua ancestralidade, é ainda hoje a doença infecciosa responsável pelo maior número de mortes a nível mundial. O agente etiológico da tuberculose é uma bactéria, Mycobacterium tuberculosis, descrita pela primeira vez por Robert Koch no século XIX. Pertence à ordem Actinomycetales e à família das Mycobacteriaceae; são bacilos, Gram-positivos, e apresentam por norma um crescimento lento e uma membrana com uma composição invulgar, rica em lípidos particulares como o lipoarabinomanano. M. tuberculosis é um patogénio particularmente resistente por se encontrar extremamente adaptado ao hospedeiro humano, e o problema agrava-se com a actual epidemia do vírus de imunodeficiência humana (VIH). Indivíduos infectados com VIH não só têm uma probabilidade maior de desenvolver tuberculose, como apresentam morbilidades mais elevadas, sendo a tuberculose a principal causa de morte entre doentes de VIH. Outro dos obstáculos mais significativos é a resistência a antibióticos, que nas últimas décadas se tem tornado mais proeminente em M. tuberculosis. Várias ocorrências de resistência aos antibióticos de primeira e segunda linha foram já documentados, e o surgimento de estirpes multirresistentes representa um sério problema de saúde pública. Continua a não existir uma vacina eficaz para substituir a BCG (Bacilo Calmette-Guérin, estirpe atenuada do agente da tuberculose bovina Mycobacterium bovis), que está em uso desde 1921, e cuja eficácia na protecção contra a tuberculose pulmonar em adultos é manifestamente insuficiente. Muita da dificuldade em combater a tuberculose está também relacionada com a sua prevalência e persistência. Segundo a Organização Mundial de Saúde, um terço da população mundial pode ser portadora de M. tuberculosis no seu estado latente, ou seja, sem desenvolver doença activa. Ainda que a doença não seja contagiosa neste estado, a sua presença no hospedeiro pode vir a manifestar-se de forma oportunista em casos de enfraquecimento imunitário, como por VIH, drogas imunossupressivas, doença concomitante ou simplesmente pelo envelhecimento. Por estas razões a investigação no combate à tuberculose está cada vez mais a dirigirse no sentido de compreender os sistemas de imunidade do hospedeiro e a sua relação com este patogénio. A pedra angular da interacção patogénio-hospedeiro é a fagocitose. É um processo de imunidade inata altamente conservado evolutivamente através do qual células eucarióticas são capazes de internalizar e digerir partículas externas ou microorganismos, eliminandoos. Certas células do sistema imunitário humano servem-se deste processo para neutralizar patogénios invasores, denominando-se células fagocitárias, ou fagócitos, entre os quais se destacam os macrófagos. M. tuberculosis é tipicamente inalado por aerossóis e nos pulmões entra em contacto com os macrófagos alveolares residentes, que oferecem a resposta fagocitária inicial. Da fagocitose fazem parte várias etapas. Tem início pela internalização das partículas, que consiste na captura e envolvimento do alvo numa vesícula endocítica. Esta é depois transportada pelo citoplasma, via elementos do citoesqueleto, e vai fundindo com outras vesículas endocíticas. Quando o grau de maturação é compatível funde-se com lisossomas, cujo conteúdo enzimático assegura uma degradação proteolítica do alvo. A este processo dá-se o nome de biogénese do fagolisossoma, e nele inicia-se a acção de proteases denominadas catepsinas, bem como óxidos nítricos e superóxidos de efeito bactericida. Depois de digerido o conteúdo fagocitado, os antigénios resultantes serão utilizados para despoletar uma resposta imunitária adquirida, levada a cabo por células T. Quando a partícula a fagocitar é o M. tuberculosis, este é capaz de subverter os mecanismos de defesa do fagócito, conseguindo sobreviver e multiplicar-se no interior da célula hospedeira. Sendo complexo o arsenal molecular de que o fagócito dispõe para combater invasores, também o é o modo como esta micobactéria o evita. O M. tuberculosis consegue impedir a maturação do fagossoma, controlando o hospedeiro através de processos que ainda não são totalmente compreendidos. Sabe-se, porém, que influencia a função de proteínas de tráfego vesicular e transporte membranar, bem como as referidas catepsinas. Sendo estes alguns dos alvos da sua virulência, tornam-se também importantes alvos de investigação biomédica, pois podem ajudar a combater a estratégia de infecção de M. tuberculosis, fortalecendo as defesas do hospedeiro. A fase de internalização das bactérias por macrófagos é um ponto crítico na infecção, uma vez que representa um dos primeiros contactos entre o patogénio e o hospedeiro, e é através dela que têm início todos os restantes mecanismos. Interessa pois compreender como é regulada a internalização, e que influência terá M. tuberculosis nessa regulação. Para estudar devidamente factores de internalização, é necessário em primeiro lugar definir o modelo de internalização de partículas inertes para estabelecer o que ocorre na fagocitose como fenómeno abrangente. Criámos um desenho experimental que nos permitiu explorar um grande número de variáveis. Fizemos variar o tipo de micobactéria: destruída no fagócito (caso de M. smegmatis) versus sobrevivente intracelular (caso de M. tuberculosis), o tempo, a multiplicidade de infecção (MOI, representa o número de bactérias por cada macrófago) e o tipo de macrófago. Para este trabalho foram utilizados três tipos de macrófagos: macrófagos derivados de monócitos humanos (HMDM), macrófagos humanos da linha celular THP-1 e macrófagos de ratinho da linha celular J774. Utilizámos também três espécies dentro do género Mycobacterium: M. tuberculosis, M. bovis BCG e M. smegmatis, sendo as duas últimas consideradas não-patogénicas. Obtendo os valores de internalização ao longo de três pontos no tempo (30 minutos, 1 hora e 4 horas) tornou-se possível traçar perfis de internalização para cada combinação de variáveis. As estirpes à nossa disposição expressavam proteína verde fluorescente (GFP) por meio de um plasmídeo replicativo, o que permitiu que os macrófagos que internalizaram micobactérias pudessem ser identificados em citometria de fluxo através da fluorescência no comprimento de onda do verde. Armados desse desenho experimental e de um protocolo de infecção eficiente que permitiu testar várias variáveis em simultâneo, descrevemos curvas de internalização para as várias combinações de macrófago-micobactéria. Destes resultados foi possível chegar à conclusão esperada de que a internalização é fortemente influenciada pelo tempo e pela multiplicidade de infecção, ou seja, estes factores condicionam fortemente a resposta fagocitária dos macrófagos. Tornou-se também evidente que os HMDM são os agentes fagocitários mais eficientes de entre os macrófagos testados, tendo sido capazes de atingir elevados níveis de internalização mais rapidamente que os restantes. Uma observação que se nos revelou pertinente foi a de que ao fim de apenas 30 minutos, todos os tipos de macrófagos foram capazes de realizar uma considerável internalização das micobactérias na amostra. Põe-se assim em causa muito do background experimental em micobactérias, que prevê infecções de duração igual ou superior a 3 horas. Este nosso trabalho sugere que infecções mais breves são não apenas funcionais, mas até preferíveis para o estudo de reguladores das fases iniciais de fagocitose, como é o caso da internalização. Infecções demasiado prolongadas podem levar à perda desta informação e a uma alteração do estado fisiológico dos macrófagos, particularmente com cargas bacterianas elevadas. Foi também importante observar que as diferentes espécies de Mycobacterium apresentam diferenças ao nível da internalização. M. smegmatis foi internalizada mais rapidamente e em maiores quantidades, seguida por M. bovis BCG e esta por M. tuberculosis. Ora, a esta ordem de internalização corresponde a ordem de inversa de patogenicidade, ou seja, com o aumento da patogenicidade diminui a internalização. Levanta-se imediatamente a sugestão de que a diminuição da internalização será um dos processos de virulência de M. tuberculosis. Parece haver uma contradição, pois sendo M. tuberculosis um patogénio intracelular esperar-se-ia que promovesse a sua internalização o mais possível. No entanto, uma carga microbiana demasiado elevada sobre as células do hospedeiro leva a processos de morte celular, privando assim M. tuberculosis do seu habitat. Força-se então um equilíbrio cuja regulação importa compreender. Para investigar o papel de factores do hospedeiro que influenciem a internalização, realizámos uma triagem sobre 71 proteínas envolvidas em tráfego vesicular e na maturação do fagossoma, a maioria pertencente aos grupos das Rab guanosina trifosfatases (Rab GTPases), catepsinas e cistatinas. Pelo silenciamento de cada uma das proteínas individualmente torna-se possível avaliar a sua contribuição para o processo de internalização, ou seja, descobrir a sua função por redução ou ausência-de-função. O silenciamento individual das proteínas foi feito por intermédio de bibliotecas lentivirais contendo plasmídeos que codificam para um pequeno RNA de interferência (hairpin), complementar ao RNA mensageiro de um gene específico. Graças a essa complementaridade o RNA mensageiro é destruído, impedindo-se assim a produção da proteína correspondente. Assim construímos uma linha knockdown de macrófagos THP-1, a qual submetemos a ensaios semelhantes aos que desenvolvemos na primeira parte dos trabalhos. Na abordagem experimental, as variáveis de tempo e MOI foram restringidas a apenas 1 hora e uma MOI de 10, pois estes valores representam um estímulo mais moderado e permitem assim realçar as eventuais diferenças provocadas pelos silenciamentos. Utilizámos nesta fase apenas M. tuberculosis e M. smegmatis na qualidade de controlo não-patogénico. Nestas condições, a grande maioria dos silenciamentos provocou um decréscimo na internalização de micobactérias, o que levou a que as suas proteínas-alvo fossem classificadas como potenciais reguladores positivos da internalização. Aplicando limites para aquilo que deveria ser considerada uma diferença significativa face aos controlos nãosilenciados, 26 proteínas emergiram como reguladores, sendo por isso denominados os hits da triagem. Este é um número surpreendentemente elevado, tendo em conta que as bibliotecas lentivirais não foram desenhadas especificamente para ensaios de internalização. Destes hits destacam-se especialmente aqueles que se manifestaram apenas em infecções com uma das micobactérias, pois permitem inferir uma relação directa com a patogenicidade. É o caso da catepsina L, identificada como hit apenas para M. smegmatis. Considerando que a ausência desta proteína levou a que M. smegmatis fosse internalizado em menor nível e, tendo presente a correlação demonstrada entre baixa internalização e patogenicidade, pode dizer-se que nesta situação M. smegmatis se comportou como uma micobactéria patogénica. Daqui se retira que o silenciamento da expressão de catepsina L pode ser uma das vias através das quais M. tuberculosis manifesta a sua patogenicidade. Três outras proteínas demonstraram um papel regulatório na internalização apenas em infecções com M. tuberculosis: Rab37, Rab38 e catepsina W. Desta última são conhecidas funções na regulação da citotoxicidade de linfócitos, mas não é claro o seu mecanismo de acção. No caso de Rab37 e Rab38, este trabalho representa a primeira associação destas à infecção por M. tuberculosis. Tratando-se de uma triagem abrangente, só será possível definir o modo de funcionamento destas proteínas com novas experiências no futuro. Os restantes 22 hits não são menos importantes; apesar de conhecida a sua associação à tuberculose, demonstraram pela primeira vez ser reguladores positivos da internalização. Há limitações ao estudar infecções in vitro, pois as conclusões a retirar não são necessariamente igualmente válidas para o contexto real de infecções por M. tuberculosis. As diferenças acentuam-se se considerarmos que neste trabalho experimental se simulou um cenário de uma primo-infecção, ou seja, o primeiro contacto entre M. tuberculosis e células humanas, sendo este um cenário artificial que não corresponde à maioria dos casos de tuberculose em humanos. É uma concessão necessária para a investigação experimental e apesar de tudo não impede que estas descobertas tenham potencial terapêutico. As proteínas aqui identificadas poderão servir para controlar mais eficazmente a infecção, se aprofundado o conhecimento sobre a sua função. Esta tese apresenta pois uma nova abordagem experimental, na forma de infecções breves e eficientes e de novos intervenientes nos primeiros passos do equilíbrio dinâmico entre patogénio e hospedeiro.Mycobacterium tuberculosis is a very successful pathogen that is able to survive and multiply inside the host’s immune cells, thus triggering the active disease of tuberculosis or alternatively entering into an asymptomatic latent state. Its success lies on a powerful subversion of the fundamental innate immunity process of human-host cells: phagocytosis. M. tuberculosis is known to resist destruction by phagocytes through a complex molecular sabotage of phagosome maturation, an integral part of the phagocytic process. On the other hand, internalization, the first and arguably most important step of phagocytosis, has not been so thoroughly investigated. In this work we outline a method for quantifying internalization of green fluorescent mycobacteria through flow cytometry. With it we provide profiles of internalization-over-time for J774, THP-1 and human monocyte-derived macrophages (HMDM), which were infected with M. tuberculosis, M. bovis BCG and M. smegmatis. From these experiments we gathered that HMDM are the most efficient in internalizing mycobacteria, that there is considerable internalization even after short time periods such as 30 minutes and also that M. tuberculosis is internalized to a lesser extent than its non-pathogenic counterparts. It is suggested that M. tuberculosis manipulates its own internalization. In order to decipher which are the host factors targeted by this subversive strategy, we performed an internalization-based screening on knockdown THP-1 macrophages. Protein knockdowns were achieved by shRNA interference from lentiviral libraries targeting a total of 71 proteins. Using the previously designed method, we identified 26 putative positive regulators of internalization including a large number of Rab GTPases and cathepsins, proteins associated with vesicular trafficking and proteolysis in the mature phagosome. Through this novel approach we were able to quantify rates of internalization, which were previously only empirically estimated, and use them as a model to highlight new potential therapeutic targets in the ongoing battle against tuberculosis.Anes, Elsa, 1964-Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-Repositório da Universidade de LisboaTimóteo, Pedro Manuel Dias, 1990-2013-11-06T19:23:20Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/9472TID:201283018enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:53:55Zoai:repositorio.ul.pt:10451/9472Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:40.817501Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
| dc.title.none.fl_str_mv |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis |
| title |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis |
| spellingShingle |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis Timóteo, Pedro Manuel Dias, 1990- Micobactérias Mycobacterium tuberculosis Teses de mestrado - 2013 |
| title_short |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis |
| title_full |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis |
| title_fullStr |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis |
| title_full_unstemmed |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis |
| title_sort |
Deciphering host factors for mycobacteria internalization during phagocytosis |
| author |
Timóteo, Pedro Manuel Dias, 1990- |
| author_facet |
Timóteo, Pedro Manuel Dias, 1990- |
| author_role |
author |
| dc.contributor.none.fl_str_mv |
Anes, Elsa, 1964- Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972- Repositório da Universidade de Lisboa |
| dc.contributor.author.fl_str_mv |
Timóteo, Pedro Manuel Dias, 1990- |
| dc.subject.por.fl_str_mv |
Micobactérias Mycobacterium tuberculosis Teses de mestrado - 2013 |
| topic |
Micobactérias Mycobacterium tuberculosis Teses de mestrado - 2013 |
| description |
Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 |
| publishDate |
2013 |
| dc.date.none.fl_str_mv |
2013-11-06T19:23:20Z 2013 2013-01-01T00:00:00Z |
| dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| format |
masterThesis |
| status_str |
publishedVersion |
| dc.identifier.uri.fl_str_mv |
http://hdl.handle.net/10451/9472 TID:201283018 |
| url |
http://hdl.handle.net/10451/9472 |
| identifier_str_mv |
TID:201283018 |
| dc.language.iso.fl_str_mv |
eng |
| language |
eng |
| dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
| eu_rights_str_mv |
openAccess |
| dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
| dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação instacron:RCAAP |
| instname_str |
Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| instacron_str |
RCAAP |
| institution |
RCAAP |
| reponame_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| collection |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository.name.fl_str_mv |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| repository.mail.fl_str_mv |
|
| _version_ |
1799134230291152896 |