Characterization of a novel whole-sporozoite vaccine against malaria

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Carvalho, Madalena Soares Ferreira de Jesus
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/56711
Resumo: Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Characterization of a novel whole-sporozoite vaccine against malariaMaláriaPlasmodium bergheiPlasmodium falciparumVacina de esporozoíto inteiroPbVacTeses de mestrado - 2022Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasMalaria is an infectious disease caused by Plasmodium parasites, P. falciparum (Pf) being the deadliest and most abundant of the human-infective species and transmitted to humans through infected female Anopheles mosquito bites. While there is still no truly effective vaccine against malaria, whole sporozoite (Wsp) vaccines are the most promising. One of them, PbVac, is a vaccine candidate developed by iMM’s Prudêncio laboratory, that uses P. berghei (Pb) sporozoites expressing the Pf circumsporozoite protein (PfCS) to elicit immune responses against the human-infective parasite. These genetically modified Pb parasites serve as cross-species immunizing platforms for expression and delivery of Pf antigens, without risking clinical manifestation of the disease. In this thesis, we aim to characterize a novel vaccine candidate based on PbVac, expressing immunogens from the liver (PfCS), blood (PfRH5) and sexual (Pfs48/45) stages of the Plasmodium life cycle, under different promoter combinations (PB1349300 pro_S1 and UIS4_S1). We determined parasite fitness and infectivity by assessing oocyst numbers and sporozoite production in infected mosquitos. We then quantified the parasites’ gliding motility and measured their potential to invade human hepatic cells (HepG2) and develop into exo-erythrocytic forms (EEFs) in vivo (C57BL/6J mice) and in vitro (HepG2 cells) by immunofluorescence microscopy (IFA). Subsequently, we demonstrated mRNA expression of the genes of interest by RT-qPCR, and further detected Pfs48/45 protein expression in infected HepG2 cells by IFA. Finally, we carried out ELISA-based assessments of antibody production against the inserted proteins following a three-immunization schedule in mice. We concluded that the genetic modifications performed did not impair parasite development or infectivity and that they express mRNA of the inserted genes. Results of protein expression and antibody production were inconclusive and demand additional experiments. Our results pave the way for further validation of our proposed candidates as a possible alternative to vaccination approaches presently under study.A malária é uma doença infeciosa causada por parasitas Apicomplexa do género Plasmodium, transmitidos aos seres humanos através da picada de mosquitos Anopheles fêmea infetados. De entre as 5 espécies de Plasmodium capazes de infetar humanos destaca-se o parasita P. falciparum, uma vez que é o mais letal e abundante. Embora esteja distribuída por diversas regiões do globo, a malária é particularmente importante nas regiões da Africa Subsariana, Ásia e América Latina, onde foi responsável, em 2020, por cerca de 241 milhões de casos e pela morte de 627 000 pessoas, a maioria das quais, crianças abaixo dos 5 anos de idade. O ciclo de vida dos parasitas Plasmodium é extremamente complexo e apresenta diversas fases, em que o parasita possui características diferenciadas e específicas. O ciclo inicia-se quando o hospedeiro humano é picado por um mosquito infetado e são injetadas centenas de esporozoítos, que se encontravam nas glândulas salivares, na corrente sanguínea. Estes deslocam-se na circulação até ao fígado onde, após atravessarem várias células, invadem e infetam um hepatócito final onde se desenvolvem, dando origem às chamadas formas exo-eritrocíticas (EEFs). Esta fase, embora obrigatória, é assintomática, passando assim muitas vezes despercebida pelo hospedeiro, e a sua duração depende da espécie do parasita responsável pela infeção. Após concluírem o seu desenvolvimento nas células hepáticas, são libertados merosomas, vesículas com milhares de merozoítos, para a corrente sanguínea, onde libertam o seu conteúdo. Os merozoítos livres infetam os eritrócitos, em ciclos consecutivos de invasão, crescimento intracelular, replicação e reinfeção, dando origem aos sintomas da doença. Desta replicação assexuada, resultam parasitas que continuam o ciclo de invasão, ao passo que as segundas originam as chamadas formas sexuais do parasita (gametócitos) que, ao circularem na corrente sanguínea do individuo infetado podem ser ingeridas em subsequentes picadas de mosquito. Dentro do vetor, os gametócitos diferenciam-se em gametas e fundem-se, dando origem a um zigoto diploide, que se transforma posteriormente num oocineto e seguidamente num oocisto. Nesta fase, o parasita sofre uma divisão mitótica originando novamente os esporozoítos que, após completarem a sua viagem até as glândulas salivares do mosquito, completando o ciclo, possibilitam a transmissão da infeção a um novo hospedeiro. Atualmente, as principais medidas de combate à malária baseiam-se no tratamento da doença, bem como no controlo das populações de vetores, com recurso à utilização de inseticidas, redes mosquiteiras e prevenção com recurso a fármacos profiláticos. No entanto a eficácia destas metodologias encontra-se em declínio, uma vez que tanto o parasita como as populações de mosquitos encontraram formas de prevalecer e ultrapassar as adversidades do meio. Deste modo, torna-se cada vez mais importante a existência de uma vacina que simultaneamente impeça o desenvolvimento da patologia, bem como a sua transmissão. As vacinas contra a malária podem ser classificadas consoante a fase do ciclo do parasita em que atuam, podendo ser: pré-eritrocíticas (esporozoíto e fase hepática); eritrocíticas (fase assexuada do parasita na corrente sanguínea); e vacinas que bloqueiam a transmissão (gametócitos/gametas e outros estádios que ocorrem no mosquito). Embora exista hoje uma vacina aprovada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para uso em larga escala, a RTS,S, esta tem eficácia moderada e cujo o efeito desaparece ao fim de 4 anos. Como tal, até à data não existe nenhuma vacina capaz de conferir proteção suficiente e duradoura contra a malária, no entanto, existem vários candidatos em desenvolvimento que têm vindo a apresentar bons resultados, sendo de destacar os candidatos de vacinação com esporozoítos inteiros (Wsp). Estas vacinas consistem na inoculação de esporozoítos previamente atenuados ou administrados em simultâneo com fármacos profiláticos, e tem como principal propósito iniciar uma resposta imunitária que seja capaz de inibir uma infeção posterior com um parasita selvagem. As vacinas atualmente em desenvolvimento utilizam parasita P. falciparum atenuados e sabe-se que este tipo de vacinação induz elevados níveis de proteção em humanos, envolvendo maioritariamente células T CD8+. Sabe-se que existe uma correlação entre o desenvolvimento hepático do parasita imunizante e a magnitude da resposta imune gerada aquando da inoculação com o mesmo, já que quanto mais extenso for o primeiro, mais pronunciada será a segunda. No entanto, existe o problema do risco de progressão da doença para a fase sanguínea, onde os sintomas aparecem. PbVac é um candidato a vacinação Wsp atualmente em desenvolvimento no Laboratório Prudêncio do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes (iMM-JLA) que utiliza parasitas P. berghei, os quais apenas causam malária em roedores, que foram geneticamente modificados para expressar à superfície a proteína circumsporozoíta do parasita P. falciparum (PfCS). Esta abordagem beneficia do fenómeno de imunização cruzada entre espécies, fornecendo uma plataforma para expressão e apresentação de antigénios de P. falciparum, sem incorrer no risco de desenvolvimento de sintomas de malária, uma vez que os parasitas P. berghei não se desenvolvem durante a fase sanguínea da infeção. Na presente dissertação, pretendemos caracterizar, tanto in vivo como in vitro, uma possível nova vacina Wsp, baseada na PbVac, expressando antigénios que abrangem todas as fases do ciclo de vida do Plasmodium (PfCS - estágio hepático; PfRH5 - estágio sanguíneo; Pfs48/45 - estágio sexual). Para isto foram usadas quatro linhagens de parasitas, diferindo nas combinações de promotores (locus PB1349300 pro_S1 e UIS4_S1) para os genes PfRH5 e Pfs48/45. Começámos por determinar a fitness e infetividade dos parasitas em mosquitos Anopheles stephensi, determinando a prevalência de oocistos na lâmina basal do intestino médio, e medindo a produção de esporozoítos nas glândulas salivares aos 10 e 21 dias após infeção, respetivamente. Os resultados obtidos foram então comparados com os resultados observados para PbVac, de onde todas as novas linhas transgénicas derivam, não se verificando diferenças significativas. Em seguida, quantificámos a motilidade dos parasitas, e explorámos a sua capacidade para invadir células hepáticas humanas (HepG2) in vitro, por microscopia de imunofluorescência. Mais uma vez, os resultados obtidos demonstram que não existem alterações significativas na mobilidade dos parasitas e, consequentemente, que a adição dos genes das proteínas exógenas não alterou o comportamento destes. Depois, avaliámos o desenvolvimento das formas exo-eritrocíticas (EEFs) tanto in vivo (células hepáticas de C57BL/6J) como in vitro (HepG2), às 46-48 horas após infeção (hpi), por microscopia de imunofluorescência. Os parasitas caracterizados no âmbito desta tese são mais pequenos e mais escassos do que acontece no caso do PbVac. Após validar que de facto os parasitas tinham a capacidade de infetar e de proliferar em células do fígado, quisemos compreender se existia expressão do mRNA dos três genes inseridos nos parasitas (PfCS, Pfs48/45 e PfRH5). Para tal, utilizámos RT-qPCR em esporozoítos, bem como em células infetas (Huh7) e células hepáticas infetadas de ratinho (C57BL/6J), tendo concluído que a expressão de mRNA ocorre em todas as linhas para todos os genes testados. A correta expressão do material genético inserido é de extrema importância na geração de respostas imunes por uma vacina Wsp. Como tal, procuramos detetar, por microscopia de imunofluorescência, a expressão das proteínas inseridas em células HepG2 infetadas com as linhas transgénicas, o que, à exceção da Pfs48/45 não foi possível. Por fim, através de ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), avaliámos a produção de anticorpos contra as proteínas desejadas após três imunizações com parasitas das linhas transgénicas que expressam os três antigénios. Foi possível verificar a existência de produção de anticorpos específicos para PfCS, mas não para as outras duas proteínas. Embora sejam necessárias mais experiências para determinar o potencial dos parasitas recémgerados como potenciais candidatos a vacinas, os resultados gerados indicam potencial para prosseguir estudos futuros sobre sua capacidade imunogénica.Prudêncio, Jorge Miguel MartinsCarvalho, Margarida Henriques da GamaRepositório da Universidade de LisboaCarvalho, Madalena Soares Ferreira de Jesus202220222024-10-30T00:00:00Z2022-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/56711enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:04:36Zoai:repositorio.ul.pt:10451/56711Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:07:15.726027Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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