Characterization of a new malaria vaccine candidate against Plasmodium vivax using genetically modified rodent Plasmodium parasites

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Duarte, Miguel Filipe, 1990-
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/15322
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
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spelling Characterization of a new malaria vaccine candidate against Plasmodium vivax using genetically modified rodent Plasmodium parasitesMaláriaVacinasPlasmodium bergheiPlasmodium vivaxTeses de mestrado - 2014Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014Malaria is an infectious disease transmitted by Anopheles mosquitoes and caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium. Despite countless efforts, there is still no effective vaccine against any of the human infective Plasmodium parasites of which P. falciparum and P. vivax are the most clinically significant. A new whole organism-vaccine has been proposed which is based on the use of genetically modified rodent parasites (P. berghei) as platforms for the delivery of immunogenic antigens of human infective Plasmodium species. The efficacy and safety of P. berghei parasites as a platform to deliver immunogenic antigens is warranted by their ability to infect human hepatocytes without being able to develop inside human erythrocytes. A genetically modified P. berghei expressing P. falciparum circumsporozoite (CS) protein, under the control of the P. berghei UIS4 promoter, (Pb(PfCS@UIS4)), was already developed and characterized as a potential vaccine candidate. Immunization of mice with Pb(PfCS@UIS4) parasites has successfully elicited an immune response capable to recognize and bind to P. falciparum sporozoites, and inhibit infection by this parasite. P. vivax malaria is the most widespread of the human-infective Plasmodium species and leads to a great socioeconomic burden worldwide. In light of this fact, and given the promising results obtained for the vaccine candidate Pb(PfCS@UIS4), a new genetically modified P. berghei expressing the P. vivax CS protein, Pb(PvCS@UIS4) was created, as a vaccine candidate against P.vivax malaria. This parasite was generated using the GIMO (Gene Insertion Marker Out) transfection method. The work presented in this thesis aims to characterize Pb(PvCS@UIS4) parasites in terms of infectivity and development across the sporogonic and pre-erythrocytic stages of the parasite life cycle, both in vitro and in vivo. Sporogonic parasite development and infectivity in the mosquito was assessed using Anopheles stephensi mosquitoes by counting oocysts in the midgut and sporozoites in the salivary glands at 10 and 21 days post infectious blood meal, respectively. No significant differences were observed between the development of Pb(PvCS@UIS4) and PbGIMO (wild-type P. berghei - transfection motherline) parasites. Pre-erythrocytic development was evaluated in vitro on Huh7 and HepG2 human hepatoma cell lines (48h p.i) and in vivo experiments on C57BL/6J mice (44 hpi), revealing that Pb(PvCS@UIS4) sporozoites can infect and develop within hepatocytes to a similar extent to PbGIMO sporozoites. Blood stage development experiments also revealed that Pb(PvCS@UIS4) parasites infectivity and development during this stage is comparable to PbGIMO. These results indicate that the insertion of the PvCS gene in P. berghei 230p neutral locus does not appear to have an impact on the parasite‟s ability to infect and develop throughout its life cycle. Additionally, CS expression was also assessed on Pb(PvCS@UIS4) sporozoites and exoerythrocytic forms (intrahepatic forms of the parasite), showing that both the endogenous PbCS and the exogenous PvCS are indeed being co-expressed on both stages. This characterization represents one of the first steps on the development of this new vaccine candidate against P.vivax malaria and the results here presented provide valuable insight in order to proceed to future studies regarding the immunogenicity and efficacy of Pb(PvCS@UIS4) as a vaccine candidate.A malária é uma doença infecciosa causada por um parasita protozoário do género Plasmodium que causa a morte entre 650.000 a 1.200.000 pessoas todos os anos, das quais aproximadamente 85% são crianças com menos de 5 anos de idade.1 Existem 5 espécies de Plasmodium capazes de causar malária em humanos, sendo P. falciparum e P. vivax as espécies responsáveis pela grande maioria dos casos.1 Estes parasitas são transmitidos sob a forma de esporozoíto através da picada de mosquitos fêmea do género Anopheles.1 Após a picada, os esporozoítos invadem a corrente sanguínea do hospedeiro e migram até ao fígado onde, após atravessarem vários hepatócitos, acabam por invadir e se desenvolver dentro de um.10,11 No interior do hepatócito, o parasita replica-se, dando a origem a milhares de merozoítos.12 Estes são libertados para a corrente sanguínea no interior de uma estrutura denominada merosoma, terminando assim a fase pré-eritrocitária da infeção.10 Uma vez na corrente sanguínea, o merosoma rompe-se e liberta os merozoítos que por sua vez vão infetar os eritrócitos, dando origem à fase sanguínea e sintomática da doença.10 Dentro dos eritrócitos os parasitas vão novamente replicar-se, dando origem a novos parasitas capazes de perpetuar o ciclo de infeção na corrente sanguínea mas dando igualmente origem a formas sexuais (gametócitos) aptas para serem ingeridas aquando da picada por novos mosquitos e de se desenvolverem dentro dos mesmos, dando origem a um novo ciclo de infeção.13 Apesar da malária causada por P. falciparum ter uma sintomatologia mais severa, a malária causada por P. vivax tem uma maior distribuição geográfica e está geralmente associada a longos períodos de morbilidade devido à capacidade que o parasita possui de gerar formas adormecidas (hipnozoítos), que podem levar a uma reincidência dos sintomas da doença.5,6 Atualmente, as medidas de combate à malária passam pelo uso de inseticidas para diminuir as populações de mosquitos transmissores, uso de redes mosquiteiras e a prescrição de fármacos profiláticos contra a malária. No entanto, a eficácia tanto dos inseticidas como dos fármacos tem vindo a diminuir ao longo do tempo devido ao aparecimento de “perfis” de resistência quer nas populações de mosquitos contra os inseticidas, quer nas populações de Plasmodium contra os fármacos existentes.1,15,17 Dadas as limitações das medidas existentes, tornou-se consensual entre a comunidade científica de que a criação de uma vacina é uma componente essencial no combate à malária, uma vez que esta permitiria não apenas prevenir a sintomatologia da doença mas também a sua transmissão. Contudo, até ao momento não existe uma vacina licenciada contra a malária.17 A RTS,S, a vacina que se encontra actualmente no estadio mais avançado de desenvolvimento, é uma vacina de subunidade, que consiste na administração de um fragmento da proteína CS do parasita Plasmodium falciparum fundido com uma matriz transportadora proveniente da superfície do vírus da hepatite B, mostrou oferecer um nível de proteção bastante modesto em humanos.27 Em particular, as respostas imunitárias observadas após vacinação com RTS,S foram maioritariamente mediadas por células T CD4+ e anticorpos contra a proteína CS, sem que os níveis de células T CD8+ detectáveis fossem muito significativos, as quais estão demonstradas como sendo as principais células efectoras na proteção imunitária contra a malária.22,30,31 Como alternativa, outros tipos de vacina contra a malária estão a ser desenvolvidos, como por exemplo, as vacinas de organismo inteiro. As vacinas de organismo inteiro consistem na administração de parasitas inteiros, previamente atenuados, com o objetivo de espoletar uma resposta imunitária capaz de inibir a infeção causada por organismos não atenuados. Vários estudos realizados com esporozoítos atenuados (P. falciparum), têm demonstrado que estas estratégias de vacinação podem garantir um alto nível de proteção em humanos.33-35,45 Além disso, as respostas espoletadas com esta estratégia de vacinação são maioritariamente mediadas por células T CD8+.32 Foi também observado que o nível de proteção é tanto maior quanto maior for a progressão do desenvolvimento do parasita no fígado.32 No entanto, estas vacinas baseiam-se na assunção que todos os parasitas administrados estão totalmente atenuados, e como tal, não progridem para a fase sanguínea da infeção. Dito isto, é fácil perceber que este princípio representa um risco para os indivíduos vacinados, uma vez que basta que um parasita escape ao processo de atenuação, para que haja progressão da infeção para a fase sintomática da doença. Como resposta a esta limitação inerente às vacinas que se baseiam no uso de parasitas atenuados, a equipa do Prudêncio Lab no IMM está a desenvolver uma nova estratégia de vacinação que se baseia no uso de parasitas de roedores (P. berghei) geneticamente modificados, como plataforma de apresentação de antigénios pertencentes às espécies de Plasmodium que causam malária em humanos, de forma a promover imunidade contra os mesmos quer por mecanismos de proteção cruzada entre espécies quer por mecanismos de proteção especifica contra os antigénios dos parasitas causadores de malária em humanos. Com o intuito validar esta nova estratégia, foram realizadas experiências no sentido de verificar que P. berghei consegue invadir e desenvolver-se em hepatócitos humanos sem progredir para a fase sanguínea, e que parasitas P. berghei geneticamente modificados para expressar a proteína CS de P. falciparum, são capazes de espoletar respostas imunológicas capazes de reconhecer e inibir P. falciparum. Foi então desenvolvido e caracterizado um novo candidato a vacina, que consiste em usar P. berghei geneticamente modificado de forma a que este expresse a proteína CS de P. falciparum sob o controlo do promotor UIS4 de P. berghei, o parasita Pb(PfCS@UIS4). Os resultados deste estudo demonstraram que P. berghei consegue de facto infetar hepatócitos humanos sem causar doença, o que faz deste parasita uma potencial plataforma de administração de antigénios imunogénicos para humanos. Por outro lado, a imunização de ratinhos com Pb(PfCS@UIS4) mostrou conduzir a respostas imunitárias capazes de reconhecer e ligar-se a esporozoítos de P. falciparum, inibindo a infeção por este parasita. Dados os resultados satisfatórios obtidos com a caracterização do parasita Pb(PfCS@UIS4), foi produzido um novo candidato a vacina contra P. vivax, o parasita Pb(PvCS@UIS4), que de um modo semelhante ao candidato anterior, consiste em usar P. berghei geneticamente modificado de forma a expressar a proteína CS de P.vivax sob o controle do promotor UIS4 de P. berghei. Deste modo, esta tese de mestrado teve como objetivo principal caracterizar o desenvolvimento deste novo parasita durante o seu ciclo de vida dentro do mosquito assim como caracterizar a sua infetividade e desenvolvimento em culturas celulares in vitro, e in vivo com ratinhos C57BL/6J. Adicionalmente, a sequência do gene PvCS usada na criação deste parasita foi analisada em detalhe e comparada com sequências referencia para o mesmo gene disponíveis na base de dados PlasmoDB de modo a identificar diferenças significativas entre a sequência encontrada no isolado de P. vivax utilizado e as diferentes populações existentes mundialmente. Ao compararmos a sequencia da PvCS usada na criação do Pb(PvCS@UIS4) com as sequencias existentes na base de dados, concluímos que as regiões N-terminal e C-terminal da proteína se mantêm conservadas, enquanto que na zona “central de repetição”, existe alguma variabilidade. De acordo com estudos anteriores, concluímos que a variabilidade encontrada no nosso isolado não é superior à que normalmente se verifica para este gene e que as alterações especificas encontradas são muito provavelmente características comuns das populações de P. vivax existentes na região geográfica de onde foi obtido o isolado utilizado neste estudo (Tailândia).47,51 De forma a caracterizar o desenvolvimento dos parasitas Pb(PvCS@UIS4) dentro do mosquito, foram contados quer os oocistos presentes no estômago do mosquito ao dia 10 após infeção quer esporozoítos presentes nas glândulas salivares entre o dia 20 e 22 após infeção. Estes números foram então comparados com os números obtidos com parasitas não-transfetados, pertencentes à linha mãe (PbGIMO) usada na transfeção dos parasitas Pb(PvCS@UIS4). Os resultados mostraram que não existem diferenças significativas entre os parasitas Pb(PvCS@UIS4) e PbGIMO, o que nos leva a concluir que a inserção da PvCS não aparenta ter qualquer impacto nesta fase de desenvolvimento do parasita. A fim de caracterizar a capacidade deste parasita se desenvolver e invadir células in vitro, foram usadas 2 linhas celulares de hepatomas humanos; Huh7 e HepG2. Estas linhas celulares foram infetadas com esporozoítos recolhidos das glândulas salivares de mosquitos infetados a partir do dia 20 após infeção. Passadas 48h da infeção, as células foram fixadas e marcadas com anticorpos de marcação nuclear e anticorpos específicos contra o parasita (anti-HSP70). Desta forma, através de microscopia de fluorescência, foi quantificado o nível de infeção e comparado entre parasitas Pb(PvCS@UIS4) e PbGIMO. Não foram observadas diferenças significativas entre os níveis de infeção observados com ambos os parasitas, o que demonstra que o desenvolvimento do parasita na fase hepática não é afetado pela presença da proteína CS exógena. Resultados idênticos foram também obtidos in vivo, em experiencias em que ratinhos C57BL/6J foram infetados por injeção i.v. de esporozoítos. Nestas experiencias, decorridas 44h após a infeção, os ratinhos foram sacrificados e os seus fígados foram recolhidos de forma a ser possível analisar os níveis de infeção por qRT-PCR e microscopia de imunofluorescência. Concomitantemente com as experiencias anteriores, a expressão da PbCS e da PvCS foi também observada com recurso a técnicas de microscopia de imunofluorescência. Como era esperado, nos parasitas Pb(PvCS@UIS4), a PbCS e a PvCS estão a ser co-expressas em esporozoítos e nas formas exoeritrocitárias presentes em hepatócitos infetados. Esta observação é extremamente relevante para a estratégia de vacinação, uma vez que é esperado que parte da imunidade gerada seja especificamente contra a PvCS. Para terminar a caracterização dos parasitas Pb(PvCS@UIS4), foi também realizada uma experiencia no sentido de caracterizar a capacidade destes parasitas infetarem e se desenvolverem durante a fase eritrocitária da doença ao longo de 9 dias após infeção. Os resultados demonstraram que não existem diferenças significativas entre a capacidade de infectar e se replicar no interior dos eritrócitos por parte dos parasitas Pb(PvCS@UIS4) quando comparados com parasitas PbGIMO. Concluindo, os parasitas Pb(PvCS@UIS4) demonstraram não apresentar nenhuma diferença significativa em termos de capacidade infetiva e de desenvolvimento ao longo do seu ciclo de vida quando comparados com a linha materna usada para transgénese. No contexto de desenvolvimento de uma vacina é importante que o parasita mantenha a sua funcionalidade de forma a conseguir apresentar o maior número possível de antigénios e desta forma, tornar a vacina mais eficaz. Adicionalmente, a PvCS está a ser expressa tanto em esporozoítos como durante a fase hepática, o que mais uma vez, no contexto desta estratégia de vacinação, é extremamente importante dado que a maior parte da imunidade contra Plasmodium é gerada durante a fase hepática. Os resultados aqui obtidos estão em concordância com os resultados previamente obtidos com o candidato a vacina contra P. falciparum, o Pb(PfCS@UIS4). Os dados aqui apresentados representam um primeiro passo na caracterização deste candidato a vacina e, como tal, serão necessárias mais experiencias, nomeadamente do ponto de vista imunológico, para averiguar a sua eficácia.Mendes, AntónioDias, Deodália Maria Antunes, 1952-Repositório da Universidade de LisboaDuarte, Miguel Filipe, 1990-2017-01-01T01:30:10Z20142014-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/15322TID:201366010enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-11-20T17:20:55Zoai:repositorio.ul.pt:10451/15322Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-11-20T17:20:55Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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