Implementação e validação do procedimento laboratorial para extração de RNA viral para diagnóstico do Covid-19, nos laboratórios da ESTBarreiro/IPS

• Autor(a) principal: Baleizão, Ana Raquel Parreirinha
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.26/43437
• topic: Extração; RNA; COVID-19; SARS-CoV-2; Chelex; Extraction

A pandemia por SARS-CoV-2, veio mudar o mundo. Muita adaptação teve que ser feita em muito pouco tempo, para se conseguir uma frente de batalha vitoriosa no combate e diagnós tico do vírus. Muitos laboratórios quiseram juntar-se a este combate e por isso, tiveram que trabalhar para conseguir ser reconhecidos e validados por entidades competentes. O IPS CO VID Lab foi um desses laboratórios que conseguiu a validação das suas metodologias na deteção do SARS-COV-2. Em particular, a presente tese de mestrado aborda a extração de RNA de amostras biológicas, com vista à deteção de SARS-CoV-2, utilizando um kit comercial de extração de RNA viral com minicolunas de spin. Foram otimizados os procedimentos do kit de extração, para au mentar a concentração do RNA extraído, através do encurtamento dos passos e eliminação do uso de um dos tampões do kit. A validação do método otimizado foi feita pela quantificação do RNA extraído e pela técnica de deteção RT-qPCR (PCR quantitativo em tempo real com transcrição reversa). Preparou-se também um meio de inativação viral de transporte, in house, para avaliar o seu uso na inativação das amostras biológicas, em alternativa ao meio de inativação viral de trans porte comercial. O seu uso foi igualmente validado através da quantificação do RNA extraído e através da técnica de deteção RT-qPCR. Para dar resposta ao grande número de testagens a realizar no IPS COVID Lab, foi desen volvido um procedimento de preparação de amostras e extração com a formação de poolings, em que juntaram várias amostras e foi feita a sua extração em simultâneo. A utilização dos poolings de amostra foi validada comparando os valores de Cp das amostras extraídas indi vidualmente com os valores de Cp do pooling das mesmas amostras, obtidos pela técnica de deteção RT-qPCR. Investigou-se também a utilização da técnica de extração de RNA com a resina quelante Che lex 100, para as amostras inativadas em meio de inativação de transporte. Verificou-se que esta técnica não é compatível com o uso do meio de inativação de transporte, uma vez que após a extração de RNA, não se verifica amplificação de nenhum dos alvos genéticos com a técnica RT-qPCR, o que indica a presença de contaminantes inibidores das reações PCR. Fez-se também a comparação das deteções de SARS-CoV-2 através de testes rápidos de antigénio (TRAg) com as deteções pela técnica RT-qPCR em amostras biológicas colhidas dos mesmos indivíduos. Este estudo permitiu concluir relativamente à menor sensibilidade dos TRAgs em comparação com a sensibilidade dos testes de diagnóstico por RT-qPCR.