Aplicação de um método fluorométrico em placa de 96 poços para a detecção de actividade de efluxo em bactérias

• Autor(a) principal: ANTUNES, Samuel Filipe Jesus
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/53802
• topic: Ciências biomédicas; Biologia molecular; Doenças tropicais; Bombas de efluxo; Synergy HT; Rotor-gene 3000; E. coli; L. plantarum; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

A resistência mediada por efluxo a compostos antimicrobianos é reconhecida como um importante mecanismo de resistência quer em células eucariotas quer em células procariotas. As bombas de efluxo são proteínas da membrana que têm como função proteger as células de efeitos tóxicos, facilitando a saída de moléculas nocivas para o espaço extracelular. Com a emergência da multirresistência a compostos antimicrobianos devido à sobrexpressão e sobre-actividade de bombas de efluxo em estirpes patogénicas, torna-se importante o desenvolvimento de métodos que permitam detectar e quantificar a actividade dos sistemas de efluxo em células bacterianas. O objectivo deste trabalho consistiu em testar, avaliar e comparar uma metodologia descrita por Coldham et al. em 2010, que se baseia na detecção de actividade de efluxo em bactérias usando o método fluorométrico em placa de 96 poços, aqui usando Escherichia coli (Gram-negativa) e Lactobacillus plantarum (Gram-positiva) como modelos e o fluorimetro Synergy HT Microplate Reader. Os resultados obtidos foram comparados com os resultados obtidos com o método fluorométrico semiautomático desenvolvido na Unidade de Microbiologia Médica, IHMT/NOVA, para o fluorimetro e termociclador em tempo real Rotor-Gene 3000, como referência. Simultaneamente foi avaliado o efeito sinérgico de compostos inibidores de efluxo na resistência intrínseca aos antibióticos nestas duas espécies modelo. Os resultados obtidos demonstraram que a) os inibidores de efluxo testados, tioridazina, clorpromazina, carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona e a arilpiperazina possuem efeito sinérgico significativo nos níveis de resistência intrínseca aos antibióticos nestas duas espécies modelo, diminuindo significativamente a CMI dos antibióticos: em E. coli o efeito modulador variou de 4x a 32x enquanto em L. plantarum variou de 64x a 128x; e b) o fluorimetro Synergy HT Microplate Reader pode ser considerado uma alternativa ao fluorimetro e termociclador em tempo real Rotor-Gene 3000. Ambos os aparelhos apresentaram resultados e capacidades analíticas semelhantes permitindo efectuar análises comparativas equivalentes de actividade de efluxo. Destes resultados podemos concluir que os inibidores de efluxo testados possuem efeito sinérgico significativo nos níveis de resistência intrínseca aos antibióticos nas duas espécies modelo testadas e que o método fluorométrico em placa de 96 poços usado para a detecção de actividade de efluxo em bactérias é confiável e reprodutível e que pode ser uma alternativa segura do ponto de vista da biossegurança para a determinação da actividade de efluxo em tempo real em estirpes clinicas multirresistentes.