Carbon Nanotubes in RNA capture – characterization and application in biotechnological processes

• Autor(a) principal: Videira, Ana Margarida Ferreira
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/12899
• topic: Separação de Ácidos Nucleicos; Adsorventes; Biofármacos; Materiais à Base de Carbono; Nanotubos de Carbono; Rna; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Biotecnologia

Nos últimos anos, a investigação tem conduzido a progressos notáveis no desenvolvimento de terapias baseadas em ácidos nucleicos. Apesar destas abordagens terem como ponto de partida o DNA, investigações recentes têm avaliado o potencial terapêutico do RNA. A compreensão das funções do RNA e do seu papel preponderante em várias doenças, destacou o seu potencial de aplicação como biomolécula terapêutica. Neste contexto, o recente desenvolvimento de vacinas eficazes baseadas em mRNA em resposta à pandemia da COVID-19 despertou ainda mais o interesse da investigação em terapias baseadas em RNA. No entanto, os processos efetivos de produção ainda enfrentam inúmeros desafios. Um dos processos mais cruciais é a recuperação e purificação do RNA, uma vez que associado ao processo de produção várias biomoléculas consideradas impurezas estão presentes, e são difíceis de eliminar pois partilham várias características com o RNA. Além disso, a presença destas impurezas no produto final pode representar problemas de imunogenicidade quando se considera a etapa final de entrega e administração terapêutica, tornando o seu processo de remoção obrigatório. Contudo, os métodos atualmente disponíveis e utilizados para o isolamento de RNA são limitados, demorados, pouco eficientes e muitas vezes requerem o uso de reagentes tóxicos, o que, para além de causar um enorme impacto a nível ambiental, pode comprometer a pureza, integridade e atividade biológica do RNA, parâmetros considerados imprescindíveis na recuperação do produto a ser aplicado biologicamente. Para responder a este problema, a utilização de materiais à base de carbono como candidatos a adsorventes para a captura de ácidos nucleicos surge como uma opção muito promissora devido às suas excelentes propriedades mecânicas, químicas e térmicas. Dentro destes materiais de carbono, os nanotubos de carbono (CNTs), destacam-se consideravelmente devido principalmente à excelente capacidade de adsorção de várias biomoléculas, o que tem potenciado a sua aplicação em diversas aplicações biológicas. Adicionalmente, os CNTs já demonstraram ser capazes de adsorver RNA. Porém, a forte interação CNT-RNA torna a dessorção de RNA um passo bastante crítico. Deste modo, neste estudo, é descrito um método eficaz, simples e economicamente mais rentável para a captura e recuperação de RNA a partir de um extrato complexo de Escherichia coli usando CNTs, comparando a eficiência do processo com outros materiais de carbono com diferentes estruturas e modificações de superfície. A amostra de lisado celular, além de conter a biomolécula de interesse, o RNA, contém proteínas bem como outros ácidos nucleicos contaminantes, como RNA e DNA genómico (gDNA). Os ensaios realizados no presente trabalho podem ser divididos em 2 partes: (1) realização de ensaios de adsorção de RNA usando CNTs de parede múltipla (multiwalled carbon nanotubes, MWCNTs) e avaliação de diferentes estratégias de regeneração dos MWCNTs para serem aplicados em novos ciclos, uma vez comprovada a incapacidade de dessorção de RNA deste material, em condições favoráveis à manutenção da sua integridade e estabilidade; (2) realização de ensaios de screening de adsorção e dessorção de RNA utilizando CNTs e outros materiais de carbono; estudo da reutilização dos materiais; avaliação do potencial de seletividade entre RNA e pDNA a partir de misturas de ácidos nucleicos e de amostras complexas de lisado, com posterior caraterização da pureza relativa e integridade do RNA recuperado. Os resultados obtidos da primeira parte do trabalho demonstraram o enorme potencial dos MWCNTs em adsorver RNA, exibindo uma capacidade máxima de adsorção de aproximadamente 175 mg/g. Quanto à capacidade de reutilizar este material, foram aplicadas estratégias de regeneração química, ultrassónica e térmica, sendo que, quando aplicada a regeneração química seguida de novo ensaio de adsorção de RNA, foi obtida a melhor percentagem de adsorção (73%) comparativamente às restantes estratégias mencionadas. Através da análise FTIR dos MWCNTs, demonstrou-se que o material foi capaz de recuperar as propriedades iniciais de superfície após terem sido aplicadas as estratégias de regeneração química e térmica. Relativamente aos resultados dos ensaios referentes à segunda parte do trabalho, foram realizados ensaios de screening de adsorção e dessorção de RNA a partir de diferentes materiais de carbono. Entre eles, os CNTs dopados com N e oxidados com HNO3 e as fibras de carbono oxidadas com HNO3, apesar de apresentarem capacidades de adsorção de RNA mais baixas, de 42% e 55% respetivamente, quando comparadas com MWCNTs e outros CNTs sem qualquer modificação de superfície, demonstraram ser capazes de dessorver o RNA capturado, obtendo percentagens de dessorção do RNA de 81% e 72%, respetivamente. Além disso, demonstrou-se a possibilidade de reutilização e reaproveitamento dos materiais pois estes foram capazes de manter a capacidade de adsorção de RNA ao longo de vários ciclos. Os resultados obtidos revelaram também a capacidade dos materiais em capturar com alguma seletividade o RNA de amostras complexas e, posteriormente, recuperá-lo sem a presença de DNA, ao longo de 3 ciclos. De notar que os CNTs dopados com N e oxidados com HNO3 apresentaram uma maior seletividade em comparação com as fibras de carbono oxidadas com HNO3. Os resultados evidenciaram também que os materiais foram capazes de capturar totalmente a quantidade de proteínas presente na amostra de lisado, sendo que no caso dos CNTs dopados com N e oxidados com HNO3 foi apenas necessário 1 ciclo de extração para capturar a totalidade de proteínas presente. A par disso, a recuperação final de RNA não foi comprometida, dado que as frações representativas de RNA dessorvido não continham a presença de proteína, possibilitando a clarificação rápida e simples do RNA. Por último, os resultados relativos aos espetros de dicroísmo circular garantiram a manutenção da integridade e estabilidade do RNA recuperado de ambos os materiais. Assim, globalmente, os resultados obtidos neste trabalho demonstram o potencial dos materiais de carbono em capturar e recuperar o RNA, permitindo o desenvolvimento de um método simples, rápido e amigo do ambiente para a captura e pré-purificação eficiente de RNA.