Detalhes bibliográficos
| Autor(a) principal: |
Lopes, Ana Catarina Gonçalves |
| Data de Publicação: |
2018 |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Idioma: |
por |
| Título da fonte: |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: |
http://hdl.handle.net/10400.6/9832
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Resumo: |
Sequências de oligonucleótidos de DNA e RNA ricas em guaninas podem associar-se inter ou intramolecularmente para formar estruturas de quatro cadeias que se designam G-quadruplex (G4). Vários oligodesoxinucleótidos de G4 têm sido alvo de estudo como potenciais agentes diagnóstico e terapêuticos funcionando como aptameros, pois têm interação específica com proteínas alvo que podem encontrar-se à superfície das células. Entre estes alvos está a nucleolina (NCL), proteína multifuncional sobrexpressa à superfície das células cancerosas, sendo por isso um alvo para o desenvolvimento estratégias para o diagnóstico e terapia do cancro. Entre os diversos aptameros G4 destaca-se o AS1411, que é um aptamero que se liga à NCL e inibe o crescimento de células cancerosas sem afetar as células normais, tendo sido alvo de ensaios clínicos humanos de fases 1 e 2. O seu comportamento seletivo tem sido de particular interesse nos últimos anos para a entrega de agentes terapêuticos ou de imagem em células cancerosas; pelo que a procura de novas estratégias com vista a melhoria das propriedades deste aptamero G4 é um foco de estudo crescente. As modificações químicas no G4 AS1411 e a formação dos conjugados com ligandos de G4, constituem uma estratégia promissora para explorar o seu potencial terapêutico e constituem a base para a formação e otimização de nanosistemas conjugados aptamero-ligando. Neste trabalho são reportados ensaios biofísicos e in vitro de derivados de fenantrolina e derivados de laranja de acridina usados para estabilizar um derivado do AS1411, designado AT11-L0. Também é proposta a síntese de novos ligandos derivados de fenantrolina. Relativamente aos ensaios biofísicos, a espectroscopia de discroísmo circular (CD) confirmou a existência de uma estrutura G4 paralela para o AT11-L0 em tampão 65 mM KCl + 20 mM K2HPO4/KH2PO4. As experiências de CD-melting demonstraram que os ligandos que provocaram maior estabilização térmica da estrutura do G4 AT11-L0 foram os derivados de laranja de acridina C8-NH2 e o C8, com ?Tm = 26,6 ºC e 23,9 ºC, respetivamente a 4 equivalentes molares. As titulações de fluorescência indicaram valores de KD entre 10-6 - 10-7 (M-1) para os ligandos derivados de laranja de acridina e de fenantrolina, indicativos de ligandos de G4 com afinidade média a elevada. Sendo que, os ligandos com maior afinidade para o AT11-L0 foram o derivado de laranja de acridina C8-NH2 (KD = 3,2×10-7 (M-1)) e o derivado de fenantrolina [32]phen2N4 (KD = 2,7×10-7 (M-1)). Já os ensaios in vitro foram levados a cabo em células HeLa vs NHDF. Foram realizados ensaios de citotoxicidade (MTT) para determinar o IC50 dos ligandos C8-NH2, C8, C5, C3 e [16]phenN2 e posteriormente para avaliar a citotoxicidade dos conjugados AT11-L0-C8, AT11-L0-C8-NH2, AT11-L0-C5, AT11-L0-C3. Os ligandos demonstraram ser citotóxicos para ambas as linhas celulares, com valores de IC50 entre 0,15 µM e 3,51 µM. Os nanosistemas conjugados aptamero-ligando demonstraram ser citotóxicos e seletivos para células HeLa. Foram ainda levados a cabo estudo de colocalização em células HeLa com o conjugado AT11-L0 - C8, através de microscopia de fluorescência confocal. Verificou-se localização preferencial dos ligandos no nucléolo das células HeLa, a internalização do aptamero AT11-L0, bem como a formação do conjugado aptamero-ligando e a sua internalização nas células. No geral, estes resultados demonstraram ser promissores para o desenvolvimento de futuros nanosistemas envolvendo aptameros G4 derivados do AS1411, conjugados com ligandos de G4 derivados de laranja de acridina e de fenantrolina. |