Role of CFTR and TMEM16 for regulated cell death
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| Data de Publicação: | 2016 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/25214 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016 |
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Role of CFTR and TMEM16 for regulated cell deathMorte programada celularApoptoseAnoctamina 6CFTRFibrose QuísticaTeses de mestrado - 2016Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016A morte celular programada é um mecanismo homeostático que desempenha um papel complementar à mitose na manutenção de uma população estável de células nos tecidos e órgãos. Este programa é ativado diariamente, removendo milhões de células danificadas ou envelhecidas. A apoptose é considerada a forma predominante de morte celular programada, garantindo a eliminação silenciosa de células, isto é, sem ativação do sistema imune. Durante a apoptose, as células sofrem uma grande variedade de modificações morfológicas e bioquímicas. Estas alterações são em grande parte mediadas por uma família de proteases conhecida por caspases. As caspases são normalmente expressas como precursores inativos ou procaspases, que adquirem atividade proteolítica na presença de um determinado estímulo. Depois de ativos, estas enzimas clivam outras procaspases, proteínas essenciais e ADN, sendo assim responsáveis pela amplificação da cascata apoptótica. A clivagem de todos estes substratos resulta na alteração fenotípica das células apoptóticas, as quais passam a apresentar uma redução no seu volume (shrinkage), condensação de cromatina e formação de protrusões na membrana plasmática (blebbing). A composição fosfolipídica da membrana plasmática é também afetada durante a apoptose. Numa célula viável, a bicamada lipídica é assimétrica: a fosfatidilserina (PS) e a fosfatidiletanolamina (PE) estão presentes no folheto interno, enquanto a fosfatidilcolina (PC) e a esfingomielina (SM) localizam-se no folheto externo. Esta assimetria é destruída pelo transporte bidirecional de fosfolípidos através da membrana plasmática, mediado por scramblases (scrambling). Particularmente, durante a apoptose, a PS é movida do folheto interno para o folheto externo, o que serve de sinal para a fagocitose das células apoptóticas, um processo essencial para a manutenção da integridade do hospedeiro. A Anoctamina 6 (ANO6) é uma proteína ubíqua e multifuncional pertencente a uma família proteica formada por dez membros homólogos entre si (ANO1-10; TMEM16 A-K). Esta é identificada como um canal de cloreto regulado por volume e ativado por cálcio (do inglês: Calcium activated Chloride Channel – CaCC), canal catiónico não seletivo, componente do ORCC (do inglês: Outwardly Rectifying Chloride Channel) e scramblase de fosfolípidos ativada por cálcio. A ANO6 participa numa enorme variedade de processos biológicos, tais como a coagulação sanguínea, desenvolvimento do esqueleto, regulação do volume e migração celular, entre outros. A identificação da ANO6 como uma scramblase de fosfolípidos levantou várias questões acerca do seu envolvimento na apoptose. Diferentes estudos indicam que esta proteína contribui para este processo como um canal iónico, participando eventualmente no shrinkage das células e na ativação de caspases. No entanto, no que diz respeito à sua função como scramblase, o papel da ANO6 é ainda incerto. O CFTR (do inglês: Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) é um canal de cloreto regulado por cAMP (Adenosina de monofosfato cíclico), expresso na membrana apical de células epiteliais do intestino, pâncreas, vias respiratórias e glândulas sudoríparas. Mutações no gene que codifica para esta proteína são a causa da Fibrose Quística, a doença mortal autossómica recessiva responsável pelo maior número de mortes na população caucasiana. Apesar da enorme diversidade de variantes de mutações identificadas (cerca de 1.500), a deleção de um resíduo de fenilalanina (F) no codão 508 localizado no cromossoma 7 (ΔF508) é encontrada em 90% dos pacientes com Fibrose Quística. Esta mutação resulta num folding aberrante do CFTR e consequentemente um defeito no seu tráfego do retículo endoplasmático para a membrana plasmática. A Fibrose Quística é principalmente caracterizada por uma por uma perturbação da homeostase iónica e fluídica. De entre os variados sintomas encontrados nos pacientes afetados, destaca-se a produção excessiva de muco espesso, infeções persistentes nas vias respiratórias pela bactéria Pseudomonas aeruginosa, infertilidade masculina e insuficiência pancreática e intestinal. Apesar dos esforços contínuos em compreender o CFTR a um nível funcional e molecular, a Fibrose Quística continua a ser considerada uma doença letal. A atenuação dos sintomas permitiu aumentar a esperança média de vida para cerca de 37 anos. No entanto, a doença pulmonar crónica e a resultante perda de função pulmonar continuam a ser os principais problemas por resolver, sendo responsáveis por 80% da mortalidade. Curiosamente, o CFTR foi previamente descrito como um regulador do estado redox intracelular, da acidificação do citoplasma e organelos e dos níveis de ceramida nas jangadas lipídicas, três processos determinantes para a apoptose e possivelmente responsáveis pela disfunção apoptótica encontrada na Fibrose Quística. Apesar de algumas observações não serem coerentes, a maioria dos estudos defende que mutações no CFTR aumentam a suscetibilidade das células para uma morte necrótica. Contrariamente ao que se sucede na apoptose, durante a necrose os componentes celulares são libertados para os tecidos circundantes e o sistema imune é ativado. Desta forma, especula-se que esta disfunção pode contribuir para as inflamações persistentes que caracterizam a Fibrose Quística. A interação do CFTR com outros canais e proteínas transportadoras tem sido tópico de investigação ao longo dos anos. De entre as proteínas identificadas, destaca-se o ORCC, um canal inativo em células viáveis e envolvido no shrinkage e scrambling de fosfolípidos durante a apoptose. Em 2010 Martins et. al identificou a ANO6 como componente do ORCC, existindo uma possível interação entre esta proteína e o CFTR. Tendo em conta todas estas evidências, o objetivo deste projeto foi o estudo da relação entre a ANO6 e o CFTR durante a morte celular programada. Particularmente, o trabalho focou-se na apoptose induzida por ROS (do inglês: Reactive Oxygen Species), uma vez que o CFTR é descrito como um regulador do estado redox intracelular. A primeira fase deste projeto baseou-se no estudo do impacto dos ROS na atividade da ANO6, não só em termos de corrente elétrica, mas também no que diz respeito à sua função de scramblase. Com este objetivo, a expressão endógena da ANO6 foi manipulada em células HEK293 e HeLa e a sua função foi analisada por patch clamp ou citometria de fluxo, após tratamento com diferentes indutores de stress oxidativo. Os resultados demonstraram que a ANO6 é ativada por ROS, transportando cloreto e catiões para o espaço extracelular no início da apoptose, um evento que contribui para o shrinkage das células. À medida que a via apoptótica avança, a ANO6 passa também a funcionar como scramblase, movendo a PS para o folheto externo da membrana plasmática. Como o silenciamento da ANO6 não diminuiu a morte celular, é concluído que esta proteína não é absolutamente essencial para a apoptose mediada por ROS. No entanto, esta observação não é surpreendente, visto que a morte celular programada é um processo essencial em qualquer sistema biológico, dependendo de uma grande variedade de moléculas e componentes. Assim, é muito provável que uma célula que não expresse a ANO6 compense este defeito com outras proteínas. A segunda parte deste trabalho focou-se na importância do CFTR para apoptose mediada por ROS e a identificação de uma possível interação funcional entre esta proteína e a ANO6. Estudos de co-expressão em células HEK293 revelaram que a presença das duas proteínas aumenta a corrente elétrica induzida por ROS e intensifica o scrambling de fosfolípidos durante a apoptose. Curiosamente, a co-expressão da ANO6 e do CFTR revelou ser suficiente para induzir uma apoptose significativa em condições controlo. Adicionalmente, a linha celular CFBE estavelmente transfetada com CFTR wt ou ΔF508 foi escolhida como uma ferramenta para o estudo da influência da mutação mais proeminente da Fibrose Quística na apoptose. A indução de stress oxidativo nas duas linhas celulares demonstrou que a expressão do CFTR wt intensifica a apoptose, um fenómeno independente da abertura do poro e ativação do canal. Em suma, este estudo permitiu demonstrar que a ANO6 e o CFTR cooperam durante a apoptose mediada por ROS. Estas duas proteínas revelaram ter uma relação funcional no que diz respeito à ativação de uma corrente iónica e também ao scrambling de fosfolípidos. É especulado que a expressão do CFTR na membrana plasmática aumenta a atividade da ANO6, envolvida nestes dois fenómenos apoptóticos. No entanto, é também provável que o contrário seja verdade, visto que a ANO6 foi já identificada como componente das correntes induzidas por cAMP em células que expressam o CFTR. A compreensão do papel da ANO6 e do CFTR durante a morte celular programada pode servir de motor para obter uma nova visão acerca da disfunção apoptótica encontrada na Fibrose Quística e, eventualmente, desenvolver novas terapias como tentativa de atenuar o processo inflamatório.Regulated or programmed cell death is defined as an intracellular program that plays a complementary role to mitosis in maintaining a stable population of cells. Apoptosis is the main form of regulated cell death, allowing the silent elimination of harmed or aged cells without triggering any inflammatory response. Anoctamin 6 (ANO6, TMEM16F) is a multifunctional protein from a family of ten members, identified as an endogenous Ca2+-activated Cl- channel (CaCC). Apart from its function as a CaCC, ANO6 is also described as a volume-regulated and outwardly rectifying Cl- channel (ORCC), a non-selective cation channel and a Ca2+-dependent phospholipid scramblase. It has an ubiquitous expression, being involved in many physiological processes including apoptosis. Nonetheless, ANO6 role in this process is not entirely understood. The Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) is a cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-gated Cl- channel expressed in the apical membrane of epithelial cells from the intestine, pancreas, airways and sweat glands, where it is responsible to maintain ion and fluid homeostasis. Moreover, it regulates the intracellular redox status, acidification and ceramide content in lipid rafts, three different functions that may explain CFTR involvement in apoptosis. Mutations in the CFTR gene are the cause for Cystic Fibrosis (CF), the most common life-threatening autosomal recessive disease in Caucasians. Understanding ANO6 and CFTR role in regulated cell death may help to overcome the apoptotic dysfunction found in Cystic Fibrosis. Here it is shown that ANO6 is activated by ROS (Reactive Oxygen Species) during apoptosis, acting as a Ca2+-activated Cl- channel, non-selective cation channel and phospholipid scramblase in different in vitro systems. The channel has a dual contribution for this process, transporting ions to the extracellular space and mediating phosphatidylserine (PS) exposure in the outer membrane leaflet. Furthermore, a CFTR contribution to ROS-mediated apoptosis was found in CFBE cells, a mechanism independent of pore opening and channel stimulation. Co-expression studies of ANO6 and CFTR in HEK293 cells revealed a functional relationship of these proteins during ROS-mediated apoptosis not only in terms of whole-cell current but also regarding phospholipid scrambling. A possible interaction between ANO6 and CFTR is also proposed to explain why cells overexpressing both proteins have an enhanced spontaneous and ROS-induced apoptosis. Exposure of cells to oxidative stress and consequent ROS production leads to mitochondrial permeabilization, release of Ca2+ and pro-apoptotic proteins, responsible for caspase cleavage. These events terminate with ANO6 activation, which may support cell shrinkage and phospholipid scrambling, two apoptotic hallmarks enhanced in the presence of CFTR.Kunzelmann, Karl,1958-Amaral, Margarida,1958-Repositório da Universidade de LisboaSimões, Filipa Bica2016-12-13T13:22:30Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/25214TID:201343479enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:14:41Zoai:repositorio.ul.pt:10451/25214Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:42:14.662413Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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