Marine Bioprospecting for Drug Discovery: Exploring Novel Toxin-derived Bioactives from Venomous Annelids

• Autor(a) principal: Faustino, Catarina Augusta Florêncio
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/161206
• topic: Marine natural products; recombinant protein; Escherichia coli; cysteine-rich secretory proteins; toxicity; in vitro assays; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias

A vasta biodiversidade marinha faz do oceano uma fonte quase inesgotável de compostos bioativos com significativo potencial biotecnológico, com ênfase nos invertebrados marinhos. Particularmente, as toxinas apresentam alto valor, pois tendem a evoluir para interagir com alvos moleculares específicos como meio de proteção, defesa ou predação. Assim, as toxinas, principais componentes bioativos de venenos e secreções similares, revelam potencial para o desenvolvimento de novos fármacos. A presente tese contribuiu para a investigação do potencial biotecnológico de uma nova proteína rica em cisteínas derivada das secreções de uma Polychaeta marinha, Hediste diversicolor. A expressão heteróloga da proteína recombinante foi bem-sucedida. A proteína foi preferencialmente expressa em Terrific Broth utilizando a estirpe de Escherichia coli BL21(DE3), induzida com 1mM de IPTG e incubada a 18ºC durante a noite, tendo sido identificada na fração solúvel e insolúvel. Após otimização das condições de expressão heteróloga, a proteína foi caracterizada quanto ao seu peso molecular (26kDa-31kDa) por SDS-PAGE e Western blot. O ponto isoelétrico da proteína (7.7) foi determinado por Focagem Isoelétrica, sendo próximo do valor teórico. Um extrato enriquecido com a proteína recombinante foi obtido após Cromatografia de Afinidade com Metal Imobilizado e utilizado em ensaios in vitro para avaliar a toxicidade da proteína e o seu potencial para causar danos moleculares. A análise microscópica confirmou a qualidade das células utilizadas nos citoensaios especialmente desenvolvidos com células primárias de guelras de mexilhão. A proteína foi ainda purificada usando Cromatografia de Exclusão de Tamanho, atingindo ≈86% de pureza. As concentrações proteicas testadas não causaram citotoxicidade significativa ou danos moleculares, o que pode ter implicações significativas para futuros projetos, pois acredita-se que a proteína tenha um importante papel antimicrobiano, embora ainda a ser apurado. A clonagem e expressão bem-sucedidas estabelecem um precedente importante para o teste e exploração de novos bioativos proteicos marinhos para fins de descoberta de fármacos.