Role of CTF18-RFC complex in human DNA replication programs

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Maria João Rodrigues da, 1987-
Data de Publicação: 2011
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/5794
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
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spelling Role of CTF18-RFC complex in human DNA replication programsBiologia molecularInstabilidade genéticaProteína mediadoraReplicação de DNACiclo celularTeses de mestrado - 2010Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010A instabilidade genética é uma propriedade constitutiva das células tumorais que contribui para a progressão do processo de cancerigénese. Trabalhos recentes indicam que esta instabilidade surge num estado bastante precoce da tumorigénese como consequência de defeitos de replicação (Halazonetis et al., 2008). Contudo, os mecanismos moleculares envolvidos não se encontram ainda bem esclarecidos. Os garfos de replicação são estruturas muito frágeis que encontram frequentemente obstáculos como complexos proteicos ou lesões de ADN. A paragem não controlada destes garfos pode provocar a formação de quebras cromossómicas (Tourrière et al., 2005) devido à acumulação de ADN de cadeia simples. Com o propósito de limitar esta instabilidade genómica durante a fase S, as células desenvolveram sistemas de vigilância chamados checkpoints da fase S, vias de transdução de sinal conservadas na evolução que estão frequentemente desreguladas nos cancros. Um conhecimento mais aprofundado destes mecanismos deverá permitir-nos compreender melhor a origem da instabilidade genética das células tumorais e, também, de potenciar o efeito de agentes genotóxicos que têm como alvo os garfos de replicação. Os mecanismos de replicação são altamente conservados entre os eucariotas, portanto a estratégia abordada no nosso laboratório é monitorizar as respostas a stress replicativo num modelo simples, a levedura de gemulação S. cerevisiae, e então realizar estes estudos em células humanas. Recentemente, iniciámos um estudo em grande escala que visa identificar novos factores implicados na detecção de paragens dos garfos de replicação em S. cerevisiae. Este estudo permitiu-nos identificar a proteína CTF18 como um novo mediador do checkpoint de replicação, essencial para a sua activação, implicado na manutenção da integridade dos garfos de replicação (Crabbé et al., in press). CTF18 (Chromosome Transmission Fidelity Factor 18 homolog) faz parte de um complexo RFC alternativo que realiza o loading da proteína PCNA, factor de processividade das polimerases epara o ADN. O complexo proteico heteropentamérico RFC é composto por uma subunidade grande (RFC1) e quatro pequenas subunidades (RFC2 a 5). Em eucariotas, foram identificados três complexos loaders de PCNA envolvidos em respostas checkpoint (Rad17-RFC), coesão entre cromatídios irmãos (CTF18-RFC) e manutenção da estabilidade genética (Elg1-RFC). CTF18 é necessário para a transmissão cromossómica precisa em leveduras e é altamente conservado em eucariotas. Ao contrário de outros complexos RFC, CTF18-RFC também se associa com os factores de coesão da cromatina Dcc1 e CTF8 para formar um complexo heteroheptamérico e é necessário para o estabelecimento da coesão entre cromatídios irmãos durante a fase S (Lengronne et al., 2006). Este complexo deposita também PCNA no ADN de cadeia simples numa reacção dependente de ATP. O objectivo do meu trabalho foi caracterizar a função de CTF18 na resposta ao stress replicativo em células humanas normais e tumorais. Em primeiro lugar mostrei que, como em S. Cerevisiae, CTF18 humano está associado à cromatina apenas na fase S. De seguida, procurei determinar em que medida esta proteína contribui para a activação do checkpoint de replicação. Para isto, utilizei diferentes siRNAs e shRNAs que permitem uma depleção parcial ou completa de CTF18 em diferentes linhas tumorais (HCT116, HeLa, HEK293T and U20S) assim como em fibroblastos primários (IMR90). A activação do checkpoint de replicação foi analisada em presença ou em ausência de HU (um inibidor da síntese de dNTPs) em células controle ou células com depleção de CTF18 através da análise de CHK1 fosforilada/activa. CHK1 é a cinase efectora do checkpoint de replicação de ADN que fosforila a fosfatase Cdc25 de forma a bloquear a progressão do ciclo celular em resposta a stress replicativo. Aquando da depleção de CTF18 com siRNAs e com a linha celular estável induzindo shRNAs, tanto na ausência como na presença de stress, não consegui detectar diferenças significativas na activação do checkpoint. Surpreendentemente, observei uma indução mais rápida do checkpoint de replicação de ADN em células deficientes em CTF18 expostas a HU, o que poderia indicar um aumento do colapso dos garfos de replicação nestas células sob stress replicativo. Para testar esta possibilidade, tenho utilizado a técnica de Combing Molecular de ADN para determinar se CTF18 é necessário na progressão normal dos garfos de replicação e/ou para recuperação após um stress genotóxico. Este método utiliza um menisco de ar/água para alongar e alinhar moléculas individuais de ADN de uma maneira uniforme. Neste processo, o ADN liga-se a lamelas silanizadas pelas extremidades e as moléculas alinhadas são estendidas a 150% do seu comprimento cristalográfico pelo menisco de ar que recua com uma velocidade constante exercendo assim uma força constante nas moléculas aderidas. Uma vez que o ADN adere às lamelas, é irreversivelmente fixado e não se separa mesmo quando é rehidratado (Bensimon et al., 1994). O Combing Molecular permite a análise dos parâmetros de replicação (velocidade dos garfos, taxa de início de replicação) quando o ADN é extraído de células que foram marcadas com análogos halogenados de timidina como BrdU, CldU e IdU. Em experiências típicas, culturas celulares assíncronas são marcadas com pulsos de IdU e CldU de forma a determinar a orientação dos garfos de replicação. Os nucleótidos halogenados são detectados ao longo das fibras de ADN utilizando anti-corpos fluorescentes e visualizados por imunofluorescência. As distâncias percorridas pelos garfos durante as marcações são medidas usando o software MetaMorph. Neste estudo, mais de 100 moléculas individuais de ADN foram analisadas relativamente à velocidade de progressão dos garfos de replicação para cada condição experimental. Nas células transfectadas com siRNAs contra CTF18, verifiquei que os garfos de replicação se movem mais lentamente na presença de HU, que é uma reminiscência do que foi observado nos mutantes de levedura ctf18(Crabbé et al., in press). Estes dados sugerem que CTF18 humano poderá estar implicado na manutenção dos garfos de replicação retidos durante a replicação. Visto que os mutantes ctf18de levedura acumulam sinais de dano de ADN nos garfos retidos por HU, verifiquei, de seguida, se é também o caso em células humanas deficientes em CTF18. Para este fim, utilizei a forma fosforilada da variante de histona H2AX (γH2AX), como marcador de quebras simples e duplas no ADN. γH2AX foi quantificada por Western blotting em ausência e presença de stress replicativo. Um ligeiro mas reprodutível aumento de γH2AX foi observado na presença de stress em células transfectadas com siRNA CTF18, o que é consistente com os meus resultados de Combing. Estes dados sugerem que os garfos de replicação são menos estáveis nas células deficientes em CTF18 expostas a HU e que os garfos danificados induzem uma activação do checkpoint mais rápida. Em conjunto, os meus dados sugerem que CTF18 tem uma função no replissoma para conservar os garfos de replicação retidos na presença de stress, mas não tem o mesmo papel na activação do checkpoint como nas leveduras. Várias razões podem ser invocadas para explicar esta diferença. Por exemplo, a quantidade de CTF18 restante após RNA de interferência poderá ser suficiente para desempenhar a sua função no checkpoint. Tentativas têm sido feitas para melhorar a depleção de CTF18 com construções de shRNA induzíveis mas não tiveram êxito. Para além disso, em células primárias, que têm menos CTF18, a maior a depleção obtida provoca um aumento da mortalidade celular e não permitiu uma análise adicional do checkpoint. Uma outra explicação poderia ser que CTF18 humano está de facto envolvido na resposta do checkpoint da replicação de ADN, mas o defeito deste checkpoint em células deficientes em CTF18 é mascarado pela resposta do dano de ADN induzida pelo colapso dos garfos em HU. Estudos em leveduras de gemulação têm mostrado que é realmente o caso (Crabbé et al., in press). No entanto, esta possibilidade é difícil de abordar em células humanas visto que, ao contrário das leveduras, as vias dos checkpoint do dano e da replicação de ADN são altamente interdependentes e não podem ser funcionalmente separadas. Experiências adicionais são, portanto, necessárias para concluir definitivamente se CTF18 medeia ou não a resposta da replicação do ADN em células humanas, como acontece nas leveduras de gemulação.Replication fork progression is frequently challenged by DNA lesions and by natural pause sites. Arrested forks are unstable structures, which represent a major threat for the genome integrity if they are not promptly stabilized and restarted. In response to replicative stress, cells activate the replication checkpoint to prevent collapse of stalled forks and promote fork recovery. Recent evidence indicates that spontaneous replication stress occurs in precancerous lesions and promotes the development of cancer. Understanding how DNA replication stress arises in normal cells and contributes to tumorigenesis is a major challenge in cancer research. The human Chromosome Transmission Fidelity Factor 18 homolog is part of an alternative RFC complex that loads into DNA the clamp protein PCNA, the processivity factor of DNA polymerase and. In the yeast S. cerevisiae, our group has shown that CTF18 is essential for the activation of the DNA replication checkpoint (Crabbé et al., in press). We checked whether this function is conserved in human cells. To address this question, we depleted CTF18 in human cells by RNA interference and we monitored their ability to activate the DNA replication checkpoint. We were unable to detect a significant difference in cells ability to activate the replication checkpoint when depleting CTF18, except for very early activation. We next used DNA combing to check whether CTF18 is required for replication fork progression, as it is the case in yeast. Forks moved slower in absence of CTF18 in presence of stress, suggesting that CTF18 could be implicated in the maintenance of stalled forks. In the same way, we also observed a slight increase of DNA damage in CTF18 depleted cells. Altogether, these experiments suggest that CTF18 has a function at the replisome to maintain stalled forks in presence of stress but does not play the same role in checkpoint activation as in yeast.Duarte, Júlio António Bargão, 1957-Pasero, PhilippeRepositório da Universidade de LisboaSilva, Maria João Rodrigues da, 1987-2012-03-29T14:09:38Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/5794porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:47:47Zoai:repositorio.ul.pt:10451/5794Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:31:02.779129Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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