Towards improvement of Haematococcus pluvialis cultures by cell sorting and auv mutagenesis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rosa, Filipa Faria
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/27532
Resumo: Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017
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spelling Towards improvement of Haematococcus pluvialis cultures by cell sorting and auv mutagenesisAstaxantinaHaematococcus pluvialisCitometria de fluxoCell sortingMutagénese por UVTeses de mestrado - 2017Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Nowadays, there is an increased interest in biological active compounds derived from natural sources, especially compounds with medical applications, nutrient rich food and feed, and health promoting compounds. Microalgae are a potential valuable resource for a biotech purposes, as new sources of biomolecules such as pigments, lipids, carbohydrates and proteins. Natural pigments have pharmacological properties and have increased marketability of products advantages over synthetic products. Commercial production of natural carotenoids from microalgae is an eco-friendlier and safer approach than synthetic manufacture by chemical procedures. Of several naturally occurring carotenoids, astaxanthin is considered one of the best, being able to protect cells, lipids and membrane lipoproteins against oxidative damage. Haematococcus pluvialis is the richest source of natural astaxanthin and is produced at large scale. The work herein described had the objective to improve H. pluvialis strains with an enhanced accumulation of astaxanthin content. For the strain improvement three approaches have been used: (i) screening of different strains to select those with a superior performance; (ii) flow cytometry assisted cell sorting of cells subpopulations with increased astaxanthin production and (iii) random mutagenesis by UV-C irradiation and mutants selection. For this purpose, seven H. pluvialis strains were used and a characterization was conducted throughout the 3-steps cultivation experimental strategy: green vegetative growth, induction of astaxanthin accumulation and additional salinity stress stages. This integrative characterization focused on a number of microalgae physiological properties, intending to thoroughly assess the evolution and heterogeneity of their vitality and astaxanthin accumulation capacity. HP_02 and HP_03 were the most promising selected strains, reaching respectively 3.8 % and 4.4 % (of their DW) of astaxanthin content, and presenting high growth rates of 0.58 day-1 and 0.52 day-1. The two strains were submitted to fluorescence activated cell sorting for enrichment of astaxanthin over-producers. Both strains showed similar performances and no specific cell properties and/or stresses responses could be point as particularly relevant. The HP_03 strain was further subjected to random mutagenesis by exposure to UV-C radiation in order to promote heterogeneity in the cell population. The isolation of cells sub-populations of interest, with high recovery and high degree of purity, was not achieved, due to the homogeneity of the populations of the analyzed strains, and due to technical impossibility of the sorting device. However, it is noteworthy that, flow cytometry allowed the monitoring of astaxanthin content during the induction phase of the culture, and showed that the autofluorescence of this pigment can be a good indicator of its intracellular accumulation and can therefore be monitored in real time by flow cytometry. The results of the preliminary random mutagenesis assay, by exposure to UV-C radiation seem to indicate that this strategy is promising to increase the subpopulation of astaxanthin producing cells. Further similar studies with different strains and additional parameters should be performed to better clarify this subject.As microalgas estão a emergir como uma das mais promissoras fontes sustentáveis de biomassa, combustível, alimentação, rações e outros produtos. Estes microrganismos têm um potencial enorme na área da biotecnologia por serem uma fonte valiosa de metabolitos como pigmentos (ex. astaxantina, β-caroteno), proteínas (ex. ficocianina), lípidos (ex. ómega-3, DHA, EPA) e hidratos de carbono. Embora os seus compostos ativos apresentem vantagens relativamente aos produtos sintéticos ou outros produtos de fontes naturais, têm contudo, desvantagens a nível de custos (Borowitzka, 2013; Demirbas, 2011; Milledge, 2010). O maior desafio na aplicação das microalgas para fins comerciais tem sido minimizar os custos de produção e extração dos compostos, devido à complexidade da fase de cultivo e dos processos a jusante (ex. extração dos compostos de valor acrescentado). Entre os metabolitos de elevado valor acrescentado, a astaxantina (3,3’-dihidroxi-β,β’-caroteno-4,4’diona), carotenoide secundário, é considerada um composto valioso com um elevado número de aplicações, desde sectores alimentares, cosméticos a farmacêuticos. Este pigmento tem como fonte natural microalgas como Chlorella zofingiensis, Chlorococcum, Haematococcus pluvialis, leveduras vermelhas, Phaffia rhodozyma e bactérias, Paracoccus carotinifaciens. Haematococcus pluvialis, é considerada a maior fonte natural de astaxantina, podendo acumular até 6 % do seu peso seco e é a melhor fonte natural de astaxanthina para consumo humano (Ambati et al., 2014; Lorenz, 1999; Olaizola, 2003; Yuan et al., 2010). A acumulação de carotenoides secundários, como a astaxantina, é uma característica de resposta ao stress de certas microalgas como é o caso de H. pluvialis. Quando há privação de nutrientes, aumento da intensidade luminosa, salinidade, etanol e hormonas entre outros fatores desfavoráveis ao crescimento da microalga, esta começa a induzir (Sarada et al., 2002a; Su et al., 2014; Zhang et al., 2014). A fase de indução, também conhecida como fase vermelha, corresponde à produção e acumulação da astaxantina, essencial para H. pluvialis sobreviver a condições adversas (Hagen et al., 2002; Wayama et al., 2013). Devido às flutuações das condições de stress que podem ser aplicadas para iniciar o processo de indução, todas as estratégias devem ser otimizadas para que a acumulação de astaxantina seja o mais reprodutível possível. O desenvolvimento de novas tecnologias para produção de microalgas, em sistemas abertos (ex. raceways) e sistemas fechados (ex. fotobioreactores), assim como a otimização das condições de cultivo (um ou duas fases de produção) têm maximizado o crescimento e a produção de biomassa, teor de pigmentos e outros produtos, reduzindo os custos de produção à escala industrial (Der Rio et al., 2007; Fábregas et al., 2001; Shah et al., 2016). Contudo, existem ainda muitos desafios e problemas na produção a grande escala de H. pluvialis. A otimização não tem de ser restrita ao melhoramento das condições de cultivo e aos sistemas de produção. O melhoramento do desempenho das estirpes de H. pluvialis também tem sido alvo de estudos recentes. Para aumentar o conteúdo de astaxantina acumulado, as células podem ser submetidas a agentes mutagénicos químicos, como etil-metano-sulfanato (EMS) ou N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), ou agentes físicos, como radiação ultravioleta ou raio-X (Chen et al., 2003; Kamath et al., 2008; Tjahjono et al.,1994; Tripathi et al., 2001). Mutações mais direcionadas também foram aplicadas a estas microalgas, como modificações genéticas (Forján et al., 2015; Sharon-Gojman et al., 2015). O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese teve como principal objetivo o melhoramento de estirpes de H. pluvialis, pertencentes à coleção de microalgas da empresa A4F, para aumentar o teor intracelular de astaxantina. Para o melhoramento das estirpes foram utilizadas três abordagens: (i) caracterização de diferentes estirpes para posterior seleção daquelas que apresentaram desempenho superior; (ii) separação física (cell sorting) de subpopulações de células com aumento da produção de astaxantina, por citometria de fluxo e (iii) mutagénese aleatória por irradiação com UV-C e seleção de mutantes. Neste trabalho foram inicialmente utilizadas sete estirpes de H. pluvialis (HP_01 to HP_07) cultivadas numa estratégia experimental em três fases: na primeira fase de crescimento vegetativo ou fase verde, as diferentes estirpes foram crescidas em condições ótimas durante 7 dias, avaliando-se e comparando as taxas de crescimento e produtividade da biomassa; na segunda fase de indução ou fase vermelha, aplicaram-se dois fatores de stress, privação de nutrientes e aumento da intensidade luminosa (150 μmol.m-2.s-1), durante 17 dias, analisando-se a produtividade e a acumulação máxima de astaxatina nas diferentes estirpes; na terceira fase aplicou-se um stress salino adicional, analisando-se o seu impacto na biomassa e no conteúdo máximo de astaxantina das culturas já induzidas. Esta caracterização integrativa enfocou um número de propriedades fisiológicas das microalgas, com a intenção de avaliar completamente a evolução e heterogeneidade de sua vitalidade e capacidade de acumulação de astaxantina. Os parâmetros avaliados foram: contagem de células, peso seco, produtividade e viabilidade de biomassa e análise de pigmentos. Os resultados obtidos no decurso deste trabalho permitiram caracterizar as diferentes estirpes de H. pluvialis e selecionar as que apresentaram as melhores características relativamente à taxa de crescimento e produtividade de biomassa na fase de crescimento, e com especial interesse à sua produtividade e teor em astaxantina na fase de indução. Das sete, destacaram-se as estirpes HP_02 e HP_03, que durante a fase de crescimento apresentaram elevadas taxas de crescimento (0,52 e 0,58 dia-1, respetivamente) e produtividades similares de biomassa comparativamente às outras estirpes (0,27 e 0,22 g.L-1.dia-1, respetivamente). HP_02 e HP_03, obtiveram o maior conteúdo de astaxantina acumulado (3,8 % e 4,4 % respetivamente), e registaram produtividades de astaxanina elevadas, (2,31 e 2,58 mg.g-1.dia-1 respetivamente), superiores às outras estirpes estudadas. As duas estirpes foram submetidas a cell sorting para enriquecimento de sobre-produtores de astaxantina. Ambas as estirpes apresentaram desempenhos semelhantes e não foram consideradas particularmente relevantes propriedades específicas das células. A estirpe HP_03 foi ainda sujeita a mutagénese aleatória por exposição à radiação UV-C de modo a promover a heterogeneidade na população celular. Os pigmentos fotossintéticos presentes nas microalgas são clorofilas e carotenóides, e a sua concentração intracelular depende das condições de cultivo. Esta concentração está linearmente correlacionada com a fluorescência dos pigmentos, o principal componente da fluorescência endógena (autofluorescência) (Hyka et al., 2013). Assim, a intensidade de autofluorescência foi utilizada para a identificação e quantificação de pigmentos de microalgas por citometria de fluxo. Esta metodologia permitiu ainda detetar alterações no estado fisiológico das células; a morfologia, incluindo tamanho e complexidade celular dependem das condições de cultivo e estão correlacionadas com os dois sinais de dispersão da luz, medidos por citometria, nomeadamente dispersão direta (FSC) e ortogonal (SSC). A acumulação de astaxantina das 7 estirpes, foi monitorizada por citometria de fluxo, no início e ao longo da fase de indução, assim como foi seguida a evolução do estado fisiológico das células. É de salientar que os resultados da quantificação de astaxantina por citometria de fluxo (valores médios das intensidades de fluorescência) foram consistentes com os determinados pelo método de extração de pigmentos totais, confirmados pela forte correlação linear encontrada (r = 0,98) entre o conjunto completo de valores dos dois parâmetros. Demonstrou-se assim que, a autofluorescência da astaxantina é um bom indicador da sua acumulação intracelular, podendo ser monitorizada em tempo real por citometria de fluxo. Para concluir a fase de caracterização das estirpes, os resultados obtidos após adição de NaCl (10 g/L) mostraram que o aumento do conteúdo de astaxantina não é estatisticamente significativo, à exceção de HP_01 que obteve um aumento de 2,5 % para 3,4 % (p < 0,001). A aplicação do stress salino adicional, ainda que apenas durante um curto período de tempo, 1 a 2 dias, determinou um aumento do teor de astaxantina, começando as culturas a perder biomassa após o terceiro dia, e como tal teve efeitos negativos no conteúdo de astaxantina acumulado. A maior produtividade global de astaxantina foi obtida pelas estirpes HP_02 e HP_03, atingindo 1,63 e 1,88 mg.g-1.dia-1, respetivamente. Este valor foi baseado no tempo essencial para as estirpes alcançarem o valor máximo de astaxantina, incluindo as duas fases de cultivo durante 24 dias. A partir das culturas selecionadas, HP_02 e HP_03, o isolamento de subpopulações de células de interesse, com alta recuperação e alto grau de pureza, não foi alcançado, devido à homogeneidade das populações das estirpes analisadas, e devido à impossibilidade técnica do dispositivo de sorting. Como terceira abordagem para o melhoramento das estirpes, a HP_03 foi selecionada, realizou-se mutagénese aleatória por exposição à radiação ultravioleta (UV-C), criando condições propícias a que as células sofressem alterações genéticas de modo a potenciar a produção de astaxantina. O efeito letal da exposição à radiação foi estudado analisando a viabilidade celular por citometria de fluxo, usando como fluoróforo um oxonol [DiBAC4(3)], que responde ao potencial de membrana. Os resultados obtidos permitiram seguir a evolução da viabilidade celular com o aumento do tempo de exposição à radiação, observando-se uma despolarização progressiva da membrana, que terminou ao fim de 100 s de exposição por uma dissipação generalizada do potencial. No entanto, nos resultados obtidos pela análise de citometria de fluxo, não foi notável um aumento da heterogeneidade populacional, mantendo-se a dificuldade da realização do sorting das células com maior conteúdo de astaxantina. Este ensaio preliminar de mutágenese aleatória apresentou resultados promissores, na medida em que um dos mutantes isolados, Mut 2, atingiu valores superiores de astaxantina, 4,1 % por peso seco, relativamente ao controlo que obteve 3,1 % de astaxantina, para o mesmo período de tempo. Uma vez que as estirpes selecionadas apresentaram um desempenho análogo e uma homogeneidade populacional, torna-se difícil identificar propriedades celulares ou respostas ao stress que possam ser particularmente relevantes para o melhoramento das estirpes com vista a uma maior acumulação de astaxantina. Deverão realizar-se novos estudos com recurso a estirpes com maior heterogeneidade, que possibilitem o isolamento das células com as propriedades desejadas, e as configurações do citómetro de fluxo e do dispositivo de sorting devem ser otimizadas de modo a permitir separação física (cell sorting) de subpopulações de células com aumento da produção de astaxantina, com alta recuperação e alto grau de pureza.Guerra, Luís Tiago MarquesTenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952-Repositório da Universidade de LisboaRosa, Filipa Faria2017-04-26T09:55:56Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/27532TID:201693550enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:18:34Zoai:repositorio.ul.pt:10451/27532Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:43:56.819580Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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