Identification of small molecules with impact on S-Adenosyl-L-Homocysteine Hydrolase activity: potential modulators of cell methylation status

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vieira, João Pedro Fernandes
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/24966
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
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spelling Identification of small molecules with impact on S-Adenosyl-L-Homocysteine Hydrolase activity: potential modulators of cell methylation statusS-Adenosyl-L-homocysteine hydrolaseProtein methylationMethionine cycleMethylated S-adenosyl-L-homocysteine hydrolasePRMT1 target proteinsTeses de mestrado - 2016Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016S-Adenosyl-L-homocysteine hydrolase (SAHH) is an enzyme of the sulfur amino acid metabolism that catalyzes the hydrolysis of S-adenosylhomocysteine (SAH) into L-homocysteine (L-Hcy) and adenosine (Ado). SAH is, simultaneously, a byproduct and a competitive inhibitor of most cell transmethylation reactions. Excess SAH induces cell hypomethylation which has been associated with several diseases. SAHH activity, by regulating SAH concentrations, may impact on cell methylation potential and homeostasis. SAHH has been identified as a potential substrate for methylation of its arginine residues by specific methyltransferases, namely protein arginine methyltransferase 1 (PRMT1). By affecting SAHH enzyme activity, this phenomenon could constitute an additional process of cellular methylation status regulation. Therefore, it is our aim to confirm SAHH in vitro methylation and characterize, functionally and structurally, the unmethylated and methylated forms of the recombinant human protein (hSAHH). The hSAHH protein was produced in E. coli in fusion with a hexahistidyl tag allowing protein purification using immobilized metal affinity chromatography. The purified SAHH’s activity and susceptibility to limited proteolysis were characterized. Differential scanning fluorimetry (DSF) was performed in the absence and presence of several low molecular weight compounds involved in the sulfur amino acid metabolism. The SAHH methylation was performed according to standard protocols using Sadenosylmethionine (SAM) and PRMT1. The developed expression system and the affinity purification protocol allowed us to obtain hSAHH in high yield and with a high purity grade (>98%). The DSF data suggest that SAM, the universal methyl donor, is able to bind SAHH. Additionally, we also shed some light into the enzymatic mechanism of hSAHH by showing the order of substrate binding in the reverse catalytic reaction since Hcy could not bind to the enzyme. Quantification, by HPLC, of ADMA (asymmetric NG,NG-dimethylarginine) residues after hSAHH methylation and hydrolysis confirmed that the protein is a target for PRMT1 activity. Furthermore, methylated hSAHH presented lower catalytic activity and a more closed conformation. Taken together, our data strongly suggest that methylation of hSAHH may constitute an additional molecular mechanism of cellular methylation status regulation.A S-adenosil-L-homocisteína hidrolase (hSAHH; EC 3.3.1.1) é uma enzima interveniente no metabolismo da metionina. Este metabolismo inicia-se com a ativação da metionina a S-adenosil-L-metionina (SAM), que é o composto dador universal de grupos metilo nas células eucariótas. São conhecidos mais de 100 compostos que funcionam como aceitadores do grupo metilo fornecido pelo SAM, e estes incluem moléculas tão importantes como DNA, RNA e proteínas. Estas reações de transmetilação ocorrem através da ação catalítica de metiltransferases específicas e resultam na metilação do substrato e na formação de S-adenosil-L-homocisteína (SAH). A SAHH vai catalisar quer a hidrólise de SAH em L-homocisteína (Hcy) e adenosina (Ado), quer a reação no sentido inverso, ou seja, a síntese de SAH a partir da condensação da Hcy com Ado. No entanto, em condições normais a Hcy é rapidamente metabolizada, favorecendo a síntese de Hcy, e não de SAH. Curiosamente, a SAH não é apenas um subproduto das reações de transmetilação celular, mas igualmente um potente inibidor das metiltransferases celulares dependentes de SAM. Com efeito, a acumulação de SAH poderá originar um ambiente celular de hipometilação. Por esta razão, a atividade da SAHH, regulando as concentrações de SAH, terá um importante impacto sobre o potencial de metilação e homeostase celular. Tendo em consideração o exposto, este trabalho teve como objetivo inicial caracterizar estrutural e funcionalmente a hSAHH, bem como procurar moléculas relacionados com o metabolismo dos aminoácidos sulfurados que ao ligarem-se à enzima fossem potenciais modulares da atividade da hSAHH. Para alcançar o nosso objetivo, foi desenvolvido um sistema de expressão procariota e de purificação por cromatografia de afinidade que nos permitiu obter a proteína hSAHH recombinante com um elevado rendimento e um excelente grau de pureza. A proteína recombinante hSAHH foi caracterizada em relação às propriedades enzimáticas e algumas propriedades biofísicas, tais como a estabilidade térmica e flexibilidade conformacional. A otimização do ensaio de quantificação da Hcy permitiu calcular a atividade enzimática específica da hSAHH recombinante (776.2 ± 18.51 nmol Hcy.min-1.mg-1) assim como o Km (9.07 μM) e o Vmax (1024 nmol Hcy.min-1.mg-1). Por fluorimetria diferencial de varrimento (DSF) foi determinado o Tm da hSAAH na ausência e na presença de moléculas direta ou diretamente envolvidas na via da metionina. Assim, demonstrámos que a Ado, a SAM, a deoxi-adenosina e a 2'3'-dideoxiadenosina (ADA) conduzem a aumentos significativos no Tm da hSAHH o que permitiu a determinação das suas constantes de ligação (kB). Uma vez que os dados obtidos por DSF sugerem a ausência de ligação da hSAHH à Hcy (substrato da enzima) confirmámos assim o mecanismo de ação enzimática proposto para sentido da síntese de SAH. Este resultado pode ser interpretado como uma indicação da importância das possíveis modificações na conformação da enzima na catálise enzimática, promovidas pela ligação da adenosina à enzima. Os ensaios de proteólise limitada permitiram demonstrar que a hSAHH apresenta elevada resistência à proteólise, sugerindo uma baixa flexibilidade conformacional e/ou uma estrutura mais compacta. Estudos anteriores identificaram a SAHH como um substrato potencial para a dimetilação assimétrica de resíduos de arginina (resíduos ADMA) pela ação de proteína arginina metiltransferases tipo 1 (PRMTs). A metilação proteica é uma modificação pós-tradução comum que pode afetar a função da proteína-alvo. Ao afetar putativamente a atividade enzimática da SAHH, este fenômeno pode constituir um processo molecular adicional para a regulação do estado de metilação celular. Tendo em conta estas considerações, foi nosso objetivo confirmar se a SAHH é alvo de metilação pelas PRMTs referidas. A PRMT 1 é o membro das PRMTs tipo 1 mais importante nas células eucariotas. Assim, no presente trabalho pretendemos confirmar que a SAHH é um alvo de metilação para a PRMT1 e caracterizar, funcional e estruturalmente, as formas não metilados e metilados da proteína SAHH humana recombinante (hSAHH). Para tal, procedemos a uma reação de metilação da hSAHH in vitro, usando PRMT1 e SAM e obtendo desta forma hSAHH metilada. Seguidamente confirmámos que a hSAHH tinha sido de facto um alvo de metilação pela PRMT1, quantificando, por HPLC, o teor de ADMA libertado através duma hidrólise ácida da hSAHH metilada e não metilada. A proteína metilada foi então caracterizada relativamente à sua atividade enzimática e propriedades biofísicas. Assim, demonstrámos que a hSAHH metilada apresenta apenas cerca de 60% da atividade residual e um aumento da sua resistência à proteólise. Estes resultados indicam que a metilação da enzima leva a uma alteração da sua conformação tornando-a mais compacta e provavelmente dificultando a acessibilidade do substrato ao centro ativo. Ao demonstrarmos que a hSAHH é alvo de metilação a qual resulta em alterações da sua atividade catalítica abrimos novas perspetivas para o estudo mais detalhado da metilação desta proteína e das suas consequências no fluxo do metabolismo dos aminoácidos contendo enxofre.Leandro, Paula P.Castro, Rita A.Repositório da Universidade de LisboaVieira, João Pedro Fernandes2017-12-01T01:30:16Z201620152016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/24966TID:201251558enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-11-20T17:29:42Zoai:repositorio.ul.pt:10451/24966Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-11-20T17:29:42Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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