Clonagem e expressão de proteínas de ligação à penicilina e pseudomonas aeruginosa

• Autor(a) principal: Garcia, Francisco de Água Rosada
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.26/38296
• topic: Pseudomonas aeruginosa; Proteínas de ligação à penicilina; Clonagem; Proteínas recombinantes; Penicillin binding proteins; Cloning; Recombinant proteins

A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa metabolicamente versátil e oportunista que pode causar diversas infeções graves e persistentes em doentes com graves condições médicas. O tratamento destas infeções é dificultado pela resistência adaptativa da bactéria, que apresenta capacidade para crescer formando biofilmes e produzir uma variedade de fatores de virulência. Estes fatores de virulência são importantes para neutralizar as defesas do hospedeiro e provocar danos nos tecidos do mesmo. O tratamento de infeções causadas por esta bactéria é dificultado pela elevada resistência a diversos antibióticos. As proteínas de ligação a penicilinas (PBPs) são enzimas essenciais na síntese dos peptidoglicanos presentes na parede celular. Os peptidoglicanos permitem que as bactérias resistam a pressões elevadas, dão forma à célula bacteriana, e participam na divisão celular, entre outras funções. Ao longo dos anos, estas enzimas têm sido alvo de investigação, pois estão envolvidas nos mecanismos de resistência a diversos antibióticos β-lactâmicos. Neste trabalho, pretendeu-se clonar os genes de P. aeruginosa que codificam para as PBPs mais relevantes em termos clínicos em sistemas de expressão E.coli-pET28a(+). Posteriormente estas proteínas serão utilizadas, no grupo de investigação, para o desenvolvimento de novos fármacos. As proteínas selecionadas para a clonagem foram a PBP1b, PBP4 e PBP7. Inicialmente, extraiu-se o gADN de P. aeruginosa e amplificaram-se por PCR as regiões a clonar utilizando primers específicos. Os produtos de amplificação obtidos apresentaram os tamanhos esperados. Posteriormente, as sequências de interesse foram digeridas e inseridas em vetores de expressão pET28a(+). Foram obtidos transformantes positivos apenas para a proteína PBP7. A enzima PBP7 foi selecionada para sobre-expressão e purificação por cromatografia de afinidade em matriz de níquel. Confirmou-se a presença da proteína em todas as etapas por SDS-PAGE. Analisando os resultados é possível verificar uma banda de interesse com um peso molecular de aproximadamente 33 kDa após a indução da expressão da proteína. No entanto, após a etapa de purificação a banda correspondente à proteína de interesse não é visível. Futuramente, será necessário otimizar a expressão e purificação da enzima PBP7 para que seja possível a sua utilização no grupo de investigação para testar novos fármacos