Effect of RANK+ breast cancer cells’ secretome in monocytic differentiation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Castro, Laura Teixeira
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/57364
Resumo: Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2022
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spelling Effect of RANK+ breast cancer cells’ secretome in monocytic differentiationVia RANKL-RANKOsteoclastogéneseMacrófagos associados a tumorOncobiologiaDomínio/Área Científica::Ciências MédicasTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2022A via RANKL - RANK é um regulador chave da remodelação óssea e fisiopatologia de metástases ósseas, assim como um importante mediador da carcinogénese mamária mediada por hormonas. Dados preliminares do nosso laboratório sugeriram que o meio condicionado (conditioned media, CM) de células de cancro da mama recetor de estrogénio positivas sem amplificação de HER2 (ER+HER2-) e com sobre expressão de RANK (RANK OE) poderia induzir a diferenciação de monócitos in vitro. Esta evidência é particularmente importante, uma vez que o RANKL é uma quimiocina que participa no recrutamento de monócitos e macrófagos com expressão de RANK. Além disso, os macrófagos associados ao tumor (tumor associated macrophages, TAMs), também derivados de monócitos, podem contribuir para a inibição ou crescimento tumoral, se M1 ou M2, respetivamente. Este projeto derivou destas evidências e visou identificar as células diferenciadas da linhagem monocítica após exposição ao secretoma de células RANK OE, através da avaliação da presença de osteoclastos e/ou macrófagos M1/M2. Um painel de linhas de células de cancro da mama, e os seus clones RANK OE, foi cultivado sob condições padrão e os CM recolhidos. As células monocíticas RAW264.7 foram cultivadas durante 5 dias em condições de diferenciação ± 25% CM, ou mantidas em co-cultura com as diferentes linhas celulares de cancro da mama durante 5 dias em condições de diferenciação, e a osteoclastogénese foi quantificada através da contagem de osteoclastos (céulas gigantes multinucleadas com coloração TRAcP 5b positiva) e da quantificação da TRAcP 5b secretada por ELISA. Finalmente, a presença de osteoclastos e macrófagos M1/M2 foi avaliada através da análise de expressão de marcadores específicos, nfatc, iNOS e CD206, respectivamente, por RT-qPCR. Os nossos resultados indicam que o secretoma de células tumorais inibe a osteoclastogénese em comparação com a adição de RANKL exógeno (controlo positivo), quer com adição do CM quer em co-cultura. Nenhum dos CM ou células tumorais foi capaz de induzir osteoclastogénese na ausência de RANKL exógeno. Em ambos os ensaios, observámos células morfologicamente diferenciadas mas sem características de osteoclastos. Verificámos ainda que a sobre expressão de RANK aumenta o efeito inibitório, o que poderá estar associado com a expressão de osteoprotegerina (OPG), já descrita nestas células por nós. Não fomos capazes de confirmar a presença de macrófagos M1/M2 por RT-qPCR, mas colocamos a hipótese de que estas células possam ser macrófagos ou células dendríticas, o que requer uma investigação mais aprofundada. A caracterização das células diferenciadas, bem como do secretoma das diferentes linhas celulares do cancro da mama por multiplex cytokine profiling, poderá ser de grande importância para identificar factores putativos que afetam a diferenciação monocítica, e que podem contribuir para a progressão tumoral.The RANKL - RANK pathway is a key regulator of bone remodeling and pathophysiology of bone metastases and a major mediator of hormone-driven breast carcinogenesis. Preliminary data from our lab suggested that conditioned media (CM) from breast cancer cells that are estrogen receptor positive without HER2 amplification (ER+, HER2-) and with RANK overexpression (RANK OE) could induce the differentiation of monocytes in vitro. This evidence is particularly important since RANKL has shown to be a chemokine that participates in the recruitment of RANK-expressing monocytes and macrophages. Moreover, tumor-associated macrophages (TAMs), also derived from monocytes, can inhibit or stimulate tumor growth, if M1 or M2, respectively. This project stems from these findings and aims to identify the cells differentiated from the monocytic lineage upon exposure to the secretome of RANK OE cells, by assessing the presence of osteoclasts and/or M1/M2 macrophages. A panel of breast cancer cell lines, and their derived RANK OE clones, was cultured under standard conditions, and their CM were collected. RAW264.7 monocytic cells were cultured for 5 days under differentiation conditions ± 25% CM, or maintained in co-culture with the different breast cancer cell lines for 5 days in differentiation conditions, and osteoclastogenesis was quantified through the counting of osteoclasts (giant multinucleated cells with positive TRAcP 5b staining) and the quantification of TRAcP 5b secreted, by ELISA. Finally, the presence of osteoclasts and M1/M2 macrophages was assessed through the analysis of the expression of specific markers, nfatc, iNOS and CD206, respectively, by RT-qPCR. Our results indicate that the secretome of cancer cells inhibits osteoclastogenesis in comparison to the addition of exogenous RANKL (positive control), whether with the addition of CM or in co-culture. In both assays, we have observed morphologically differentiated cells but that did not have characteristics of osteoclasts. Furthermore, we verified that the expression of RANK increases the inhibitory effect, which might be associated with the expression of osteoprotegerin (OPG), already described in these cells by us. We were not able to confirm the presence of M1/M2 macrophages by RT-qPCR, but we hypothesize that these cells may be macrophages or dendritic cells, which requires further investigation. The characterization of these cells and of the secretome of the different breast cancer cell lines by multiplex cytokine profiling, could be of great importance in order to identify putative factors in monocytic differentiation, and which may contribute to tumor progression.Casimiro, Sandra Cristina Cara de AnjoRepositório da Universidade de LisboaCastro, Laura Teixeira2023-05-05T10:38:10Z2022-072022-07-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/57364TID:203140702enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:05:33Zoai:repositorio.ul.pt:10451/57364Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:07:47.197076Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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