Use of genomic dna-reporter tools to dissect pathological mechanisms caused by GAA expansions in Friedreich’s Ataxia

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Ana Maria Ferreira da, 1983-
Data de Publicação: 2015
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/25153
Resumo: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016
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spelling Use of genomic dna-reporter tools to dissect pathological mechanisms caused by GAA expansions in Friedreich’s AtaxiaAtaxia de FriedreichHeterocromatinaTranscrição genéticaExpansão das repetições de trinucleotídeosNeurociênciasTeses de doutoramento - 2016Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Medicina BásicaTese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016In Friedreich’s ataxia (FRDA), abnormal GAA repeat expansions in intron 1 of the frataxin gene (FXN) cause epigenetic changes and reduce FXN mRNA levels in averaged cell samples though a poorly understood mechanism. Dissecting the silencing mechanism in FRDA in situ is crucial to improve our understanding of the disease. Here, I use novel FRDA human cell models suitable for screening compounds able to upregulate FXN expression and to analyse the link between FXN nuclear localisation and expression in single cells. FXN-Luc, FXN-GAA-Luc, FXN-MS2-Luc and FXN-GAA-MS2-Luc stable human clones carry a site-specific integration of a single copy of the whole FXN locus with either 6 (FXN-Luc and FXN-MS2-Luc) or ~310 (FXN-GAA-Luc and FXN-GAA-MS2-Luc) GAA repeats in intron 1. To fluorescently label the transgenic FXN mRNA, I inserted MS2 binding sites into exon 2 of FXN-MS2-Luc and FXN-GAA-MS2-Luc transgenes by homologous recombination. The ~310 GAA repeats recapitulate the characteristic FXN gene repression and epigenetic changes seen in FRDA. I report a single-cell analysis of FXN repression in which I identify the nuclear lamina (NL) as a novel and key player in FXN transcriptional impairment and silencing. Using a multidisciplinary approach, including analysis in both fixed and living single cells, I show that expanded GAA repeats increase FXN positioning at the NL, leading to decreased numbers of FXN mRNA molecules and slower transcription kinetics in the FXN-GAA-MS2 cell model. Restoring histone acetylation reverses NL positioning. I observe the same abnormal repositioning to the NL in carrier and FRDA patient cells and show that this tightly correlates with a marked decrease in the number of actively expressing FXN alleles. Furthermore, I show that those few active expanded FXN alleles located at the NL express at a significantly lower level than the alleles located in the interior of the nucleus. Finally, I demonstrate that expanded GAA repeats predominantly disrupt FXN transcription initiation. Collectively, these results suggest repressive epigenetic modifications at the expanded GAA-FXN locus may lead to NL relocation, where further repression may occur. The mechanisms described may extend to other genetic diseases mediated by repeat expansions within regions of non-coding DNA.Na Ataxia de Friedreich (FRDA), uma expansão de repetições trinucleotídicas GAA, presentes no intrão 1 do gene que codifica a proteína frataxina (FXN), causa mudanças epigenéticas e reduz os níveis médios de RNA do gene FXN em amostras celulares através de um mecanismo pouco conhecido. Com o intuito de melhor perceber a patogénese inerente à doença e, em última análise, desenvolver terapias eficientes para a FRDA, é importante criar modelos celulares que traduzam as características repressivas da doença ao mesmo tempo que permitem quantificar eficientemente os níveis de expressão do gene FXN. As linhas celulares reporter FXN-GAA-Luc, FXN-Luc, FXN-GAA-MS2-Luc e FXNMS2-Luc, descritas nesta Tese, foram especificamente criadas de modo a permitir a comparação directa entre o efeito das repetições GAA normais e expandidas na expressão do gene FXN. Para o efeito usei: (i) todo o locus FXN com o seu promotor, intrões e exões originais e todos os elementos necessários para a expressão fisiológica do transgene, com inserção do gene luciferase no final do exão 5a; e (ii) uma única cópia de cada BAC integrado num sítio FRT especificamente localizado no cromossoma 1 de células HEK FRT, de modo a excluir efeitos contraditórios na expressão do gene FXN devido a integração de ambos os vectores em sítios diferentes. Análise das modificações das histonas no promoter do gene FXN e regiões que ladeiam as repetições GAA a montante e a jusante revelou um decréscimo da acetilação de H3K9 e H4K8 e um aumento da metilação de H3K9me2 e H3K9me3 nas três regiões nas células FXN-GAA-Luc. Adicionalmente, as regiões a montante e a jusante das repetições GAA das células FXN-GAA-Luc apresentam um aumento da metilação do DNA em CpG específicos. As células FXN-GAA-Luc foram usadas num rastreio de compostos terapêuticos e permitiram identificar uma molécula capaz de aumentar a expressão do gene FXN-GAA-Luc para níveis similares aos das células FXN-Luc. A análise usando a técnica de imunoprecipitação da cromatina em células derivadas de pacientes depois de tratadas com esta molécula revelou o restauro para níveis normais de acetilação de H3K9 e H4K8 nas regiões que ladeiam as repetições GAA. Estes resultados sugerem que as repetições GAA induzem a repressão do gene FXN nas células FXN-GAA-Luc através da alteração da estrutura da cromatina no transgene, fazendo com que estas células sejam consideradas excelentes para o rastreio de moléculas capazes de aumentar a expressão do gene FXN. No entanto, o modelo FXN-GAA-Luc apenas apresenta o estado provável do gene FXN visto que os resultados provêm de experiências onde se efectuam medições médias resultantes de amostras contento milhões de células. Consequentemente, o modelo FXNGAA-MS2-Luc foi criado para dissecar o mecanismo repressivo de FRDA in situ, permitindo a visualisação e análise da localização e repressão de FXN em células fixas e vivas usando o sistema MS2. Neste trabalho, desenvolvi um modelo celular humano para analisar a associação entre a localização e a expressão do gene FXN ao nível da célula. Os clones celulares estáveis FXN-MS2-Luc e FXN-GAA-MS2-Luc foram gerados por integração dos transgenes num local específico e contêm todo o locus FXN de 80 kb, o gene repórter luciferase no exão 5a e seis repetições ou uma expansão de ~310 tripletos GAA no intrão 1, respectivamente. Para efectuar uma marcação fluorescente do mRNA FXN transgénico e quantificar o efeito da expansão de tripletos GAA na transcrição do gene, inseri 24 repetições de locais de ligação da proteína MS2 (MBS) no exão 2 por recombinação homóloga. A expansão de ~310 GAA na linha celular FXN-GAA-MS2-Luc traduz as características repressivas do gene FXN em FRDA. A localização do transgene FXN nas linhas FXN-MS2-Luc e FXN-GAA-MS2-Luc foi determinado por Immuno-FISH. FXN contactou com a lâmina nuclear (NL) em ~44% das células FXN-GAA-MS2-Luc quando comparado com apenas ~10% das células FXNMS2-Luc. Após tratamento das células com inibidores das desacetilases de histonas, apenas o transgene FXN-GAA-MS2-Luc se reposicionou longe da NL. No entanto, ocorreu um aumento da expressão do mRNA FXN transgénico nas duas linhas celulares, sugerindo que existe uma associação complexa entre repressão do gene FXN e a sua localização intranuclear. Para aprofundar o conhecimento sobre a repressão do gene FXN, analisei o output de transcrição de alelos FXN transgénicos individuais nas células FXN-MS2-Luc e FXN-GAA-MS2-Luc por RNA FISH e recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP). As células FXN-GAA-MS2-Luc contêm ~5 ± 2 mRNAs por célula e as células FXN-MS2-Luc cells contêm ~9 ± 4 mRNA por célula, indicando que ~310 tripletos GAA reduzem o número de moléculas de mRNA em 44% ao nível celular. As curvas FRAP mostram que o tempo necessário para a recuperação completa da fluorescência após a fotodegradação é diferente nas duas linhas celulares. O transgene FXN-MS2-Luc apresentou um tempo total de recuperação de 120 segundos, enquanto o transgene FXNGAA-MS2-Luc apresentou uma cinética mais lenta com recuperação total de 260 segundos. Devido ao facto de a estabilidade do mRNA de FXN não apresentar diferenças entre as células FXN-GAA-MS2-Luc e FXN-GAA-MS2-Luc, os resultados de RNA FISH e FRAP indicam que a expansão de GAA diminui a quantidade de moléculas de mRNA de FXNGAA-MS2-Luc através do impedimento da iniciação e/ou elongação da transcrição por parte da polimerase de RNA II. De modo a elucidar a relação entre a localização e repressão do gene FXN, analisei a intensidade fluorescente de transgene activos em células FXN-MS2-Luc e FXN-GAA-MS2-Luc vivas. A intensidade fluorescente de locais de transcrição foi significativamente menor quando os transgenes estavam a expressar na periferia nuclear comparando com o nucleoplasma em células FXN-MS2-Luc e FXN-GAAMS2-Luc. Estes dados indicam que os dois transgenes expressam quando localizados na periferia nuclear, embora o façam em quantidades mais pequenas. Quando comparados com transgenes FXN-MS2-Luc activos, a intensidade dos locais de transcrição dos transgenes FXN-MS2-GAA-Luc foi significativamente mais baixa apenas no interior do núcleo. No seu conjunto, estes resultados sugerem que a expansão de GAA aumenta a localização do transgene FXN-GAA-MS2-Luc na NL, onde os níveis de expressão são reduzidos quando comparados com o interior nuclear ou com os níveis de expressão do transgene FXN-MS2-Luc. Em seguida, analisei a localização do gene no seu ambiente genómico natural em células derivadas de pessoas saudáveis, de portadores heterozigóticos de um alelo FXN mutante e de pacientes. Em células derivadas de portadores heterozigóticos, o alelo FXN contendo a expansão de GAA localiza-se preferencialmente mais próximo da periferia nuclear do que o alelo normal e contacta mais vezes com a NL. Quando se compara a localização do gene FXN em células saudáveis com células derivadas de pacientes, os resultados indicam que a expansão de GAA aumenta a probabilidade de um alelo se encontrar associado à NL e consequentemente a probabilidade de estar silenciado. Adicionalmente, quando os alelos FXN expandidos se encontravam a expressar, os níveis de expressão eram significativamente reduzidos quando se encontram no nucleoplasma, mas especialmente quando localizados na periferia nuclear. Estes resultados indicam uma relação directa entre o posicionamento do gene FXN na NL e a repressão da transcrição mediada pela expansão de GAA. A realização de uma quantificação ao nível celular mostrou ainda que a expansão das repetições de GAA induz um défice na expressão maioritariamente ao nível da iniciação da transcrição do gene FXN, mas também induz um pequeno bloqueio na elongação da polimerase de RNA II. No seu conjunto, estes resultados sugerem que as modificações epigenéticas repressivas no locus FXN expandido podem induzir a relocalização do gene para a NL, onde uma repressão adicional pode ocorrer. O efeito combinado da presença da expansão de GAA e relocalização do gene para a NL resultam numa redução catastrófica dos níveis de transcrição, levando à redução dos níveis da proteína frataxina e, em última análise, à manisfestação de FRDA. O trabalho descrito nesta Tese apresenta novos conhecimentos sobre as causas moleculares subjacentes à FRDA e poderá ser aplicável a outras doenças genéticas causadas por expansões de nucleótidos em regiões não codificantes do DNA.Wade-Martins, RichardOuteiro, Tiago Fleming, 1976-Repositório da Universidade de LisboaSilva, Ana Maria Ferreira da, 1983-2016-11-29T18:07:51Z201620152016-01-01T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/25153TID:101325592enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-11-20T17:30:39Zoai:repositorio.ul.pt:10451/25153Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-11-20T17:30:39Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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