Ensaio de hibridação em sanduíche na deteção de fungos

• Autor(a) principal: Duarte, Letícia Novaes
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/9286
• topic: Microbiologia; Alimentos; Fungos; Hibridização

A deteção precoce de contaminantes microbianos é essencial para evitar sua disseminação, no entanto a maioria das análises clássicas são lentas, inespecíficas, e limitadas a microrganismos cultiváveis. Tendo em conta estas dificuldades, têm sido desenvolvidas diversas técnicas para quantificar comunidades microbianas em um menor espaço de tempo. Métodos moleculares são os mais indicados, porém não são totalmente aceites para uso rotineiro por necessitarem de reagentes e equipamentos dispendiosos e profissionais experientes. Assim, o ensaio de hibridação em sanduíche para uma quantificação rápida, simples e barata de fungos foi avaliado. O objetivo foi otimizar as condições deste método visando obter uma resposta mais sensível a já descrita anteriormente para este grupo de organismos. Neste método duas sondas hibridam com o RNA alvo e os sanduíches formandos produzem um sinal fluorescente quantificável. Isto ocorre porque a sonda de captura imobiliza somente o RNA hibridado, desta maneira é feita a lavagem das sondas restantes e dos RNA não-alvo. Só então é adicionado o substrato que reagirá enzimaticamente com o complexo enzimaanticorpo- DIG ligado à sonda de deteção, desta maneira o sinal produzido será equivalente à quantidade de RNA alvo da amostra em questão. A levedura Saccharomyces cerevisiae foi selecionada como alvo para este estudo por ter suas características bastante conhecidas e ser um ótimo organismo modelo para eucariotos. Diversas concentrações de células foram utilizadas nos ensaios onde o limite de deteção foi de 104 células/ml.