Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model

• Autor(a) principal: Mesquita, Miguel Ângelo Martins
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/113763
• topic: Degenerescência Macular da idade; Grânulos autofluorescentes; Doenças Crónicas relacionadas com a idade; Disfunção Lisossomal; Epitélio Pigmentar da Retina; Age-related Macular Degeneration; Autofluorescent granules; Chronic age-related diseases; Lysosome dysfunction; Retinal Pigmented Epithelium; Ciências Médicas

RESUMO:O declínio da função lisossomal tem sido apontado como estando envolvido numa série de doenças crónicas relacionadas com a idade, nomeadamente em doenças neurodegenerativas, cancro, aterosclerose e retinopatias. Neste projeto colocamos a hipótese de que lisossomas disfuncionais adquirem propriedades únicas e marcadores específicos, distinguindo-se dos funcionais. Durante este trabalho, usámos o epitélio pigmentar da retina humana como modelo celular para identificar as propriedades intrínsecas de lisossomas disfuncionais. O epitélio pigmentar da retina é responsável pela fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores, necessários ao processamento visual. Desta forma, sugerimos que a disfunção lisossomal nestas células resulta da acumulação dos segmentos externos dos fotorreceptores que consequentemente leva a retinopatias. Durante este trabalho, desenvolvemos três abordagens diferentes para estudar disfunção lisossomal em contextos distintos: uma abordagem baseada na doença, um modelo genético de disfunção lisossomal e uma estratégia farmacológica. Estas abordagens constituem modelos chave para estudar marcadores comuns de doença ao combinar os diferentes resultados obtidos em cada uma das estratégias. Além do mais, otimizámos a técnica de purificação de lisossomas baseada na immunocaptura do epítopo HA em células do epitélio pigmentar da retina, o que nos permite uma análise detalhada do proteoma de lisossomas purificados de células do epitélio pigmentar da retina e avaliação de novos marcadores de doença. Adicionalmente, projetámos uma estratégia de CRISPR/Cas9 para gerar células estaminais pluripotentes que expressam proteinas lisossomais conjugadas com o epítopo HA. Este último, além de permitir o estudo da disfunção lisossomal, pode também ser usado para estudos de dinâmica lisossomal e interações no ambiente celular. Pretendemos assim estabelecer uma nova interpretação relativamente aos mecanismos moleculares que estão por detrás do desenvolvimento de variadas doenças crónicas relacionadas com a idade, ao combinar as estratégias aqui desenvolvidas com técnicas de proteómica. Deste modo pretendemos identificar novos alvos terapêuticos bem como desvendar mecanismos comuns a doenças degenerativas que apresentam declínio na função lisossomal.