Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Mesquita, Miguel Ângelo Martins
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/113763
Resumo: RESUMO:O declínio da função lisossomal tem sido apontado como estando envolvido numa série de doenças crónicas relacionadas com a idade, nomeadamente em doenças neurodegenerativas, cancro, aterosclerose e retinopatias. Neste projeto colocamos a hipótese de que lisossomas disfuncionais adquirem propriedades únicas e marcadores específicos, distinguindo-se dos funcionais. Durante este trabalho, usámos o epitélio pigmentar da retina humana como modelo celular para identificar as propriedades intrínsecas de lisossomas disfuncionais. O epitélio pigmentar da retina é responsável pela fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores, necessários ao processamento visual. Desta forma, sugerimos que a disfunção lisossomal nestas células resulta da acumulação dos segmentos externos dos fotorreceptores que consequentemente leva a retinopatias. Durante este trabalho, desenvolvemos três abordagens diferentes para estudar disfunção lisossomal em contextos distintos: uma abordagem baseada na doença, um modelo genético de disfunção lisossomal e uma estratégia farmacológica. Estas abordagens constituem modelos chave para estudar marcadores comuns de doença ao combinar os diferentes resultados obtidos em cada uma das estratégias. Além do mais, otimizámos a técnica de purificação de lisossomas baseada na immunocaptura do epítopo HA em células do epitélio pigmentar da retina, o que nos permite uma análise detalhada do proteoma de lisossomas purificados de células do epitélio pigmentar da retina e avaliação de novos marcadores de doença. Adicionalmente, projetámos uma estratégia de CRISPR/Cas9 para gerar células estaminais pluripotentes que expressam proteinas lisossomais conjugadas com o epítopo HA. Este último, além de permitir o estudo da disfunção lisossomal, pode também ser usado para estudos de dinâmica lisossomal e interações no ambiente celular. Pretendemos assim estabelecer uma nova interpretação relativamente aos mecanismos moleculares que estão por detrás do desenvolvimento de variadas doenças crónicas relacionadas com a idade, ao combinar as estratégias aqui desenvolvidas com técnicas de proteómica. Deste modo pretendemos identificar novos alvos terapêuticos bem como desvendar mecanismos comuns a doenças degenerativas que apresentam declínio na função lisossomal.
id RCAP_d4accad6e8f9c441ede9a444cd735204
oai_identifier_str oai:run.unl.pt:10362/113763
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell modelDegenerescência Macular da idadeGrânulos autofluorescentesDoenças Crónicas relacionadas com a idadeDisfunção LisossomalEpitélio Pigmentar da RetinaAge-related Macular DegenerationAutofluorescent granulesChronic age-related diseasesLysosome dysfunctionRetinal Pigmented EpitheliumCiências MédicasRESUMO:O declínio da função lisossomal tem sido apontado como estando envolvido numa série de doenças crónicas relacionadas com a idade, nomeadamente em doenças neurodegenerativas, cancro, aterosclerose e retinopatias. Neste projeto colocamos a hipótese de que lisossomas disfuncionais adquirem propriedades únicas e marcadores específicos, distinguindo-se dos funcionais. Durante este trabalho, usámos o epitélio pigmentar da retina humana como modelo celular para identificar as propriedades intrínsecas de lisossomas disfuncionais. O epitélio pigmentar da retina é responsável pela fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores, necessários ao processamento visual. Desta forma, sugerimos que a disfunção lisossomal nestas células resulta da acumulação dos segmentos externos dos fotorreceptores que consequentemente leva a retinopatias. Durante este trabalho, desenvolvemos três abordagens diferentes para estudar disfunção lisossomal em contextos distintos: uma abordagem baseada na doença, um modelo genético de disfunção lisossomal e uma estratégia farmacológica. Estas abordagens constituem modelos chave para estudar marcadores comuns de doença ao combinar os diferentes resultados obtidos em cada uma das estratégias. Além do mais, otimizámos a técnica de purificação de lisossomas baseada na immunocaptura do epítopo HA em células do epitélio pigmentar da retina, o que nos permite uma análise detalhada do proteoma de lisossomas purificados de células do epitélio pigmentar da retina e avaliação de novos marcadores de doença. Adicionalmente, projetámos uma estratégia de CRISPR/Cas9 para gerar células estaminais pluripotentes que expressam proteinas lisossomais conjugadas com o epítopo HA. Este último, além de permitir o estudo da disfunção lisossomal, pode também ser usado para estudos de dinâmica lisossomal e interações no ambiente celular. Pretendemos assim estabelecer uma nova interpretação relativamente aos mecanismos moleculares que estão por detrás do desenvolvimento de variadas doenças crónicas relacionadas com a idade, ao combinar as estratégias aqui desenvolvidas com técnicas de proteómica. Deste modo pretendemos identificar novos alvos terapêuticos bem como desvendar mecanismos comuns a doenças degenerativas que apresentam declínio na função lisossomal.ABSTRACT: The decline of lysosomal function is postulated to contribute to several age-related diseases, namely neurodegenerative diseases, cancer, atherosclerosis and retinopathies. We hypothesize that dysfunctional lysosomes acquire unique properties and biomarkers, distinct from fully active lysosomes. Here, we use the human retinal pigmented epithelium (RPE) as a cell model to identify the intrinsic properties of dysfunctional lysosomes. RPE cells are responsible for the daily phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments (POS) required for the visual process. Thus, we believe that the lysosomal dysfunction in these cells results in the accumulation of POS that ultimately leads to retinopathy. We developed three different approaches to study lysosomal dysfunction in different contexts: a disease-driven approach, a genetic-based model of lysosomal dysfunction and a pharmacological strategy. These models will be key frameworks to look for common biomarkers of disease by combining the selective readouts. Furthermore, we have optimized the lysosomes HA-based immunopurification technique (LysoIP) in RPE cells, which will allow a detailed evaluation of the proteome of immunopurified lysosomes from our human RPE cell model and the search for biomarkers of dysfunction. Additionally, we have designed a CRISPR/Cas9 strategy to generate knockin human pluripotent stem cells (PSC) expressing HA-fused lysosomal proteins. The later will provide a physiological model for the study of not only lysosomal dysfunction but other studies such as lysosomal dynamics and interactions within the cell. We believe that combining our strategies with proteomics tools will offer new insights into the molecular mechanisms behind several age-related diseases presenting declining lysosomal function, allowing the identification of new therapeutic targets and unveil missing links common to several degenerative disorders.Antas, PedroSeabra, Miguel C.RUNMesquita, Miguel Ângelo Martins2023-01-29T01:30:35Z2021-03-052021-03-122021-03-05T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10362/113763TID:202672239enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T04:56:39Zoai:run.unl.pt:10362/113763Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:42:23.176474Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model
title Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model
spellingShingle Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model
Mesquita, Miguel Ângelo Martins
Degenerescência Macular da idade
Grânulos autofluorescentes
Doenças Crónicas relacionadas com a idade
Disfunção Lisossomal
Epitélio Pigmentar da Retina
Age-related Macular Degeneration
Autofluorescent granules
Chronic age-related diseases
Lysosome dysfunction
Retinal Pigmented Epithelium
Ciências Médicas
title_short Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model
title_full Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model
title_fullStr Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model
title_full_unstemmed Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model
title_sort Purification and characterization of dysfunctional lysosomes in an age-related macular disease cell model
author Mesquita, Miguel Ângelo Martins
author_facet Mesquita, Miguel Ângelo Martins
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Antas, Pedro
Seabra, Miguel C.
RUN
dc.contributor.author.fl_str_mv Mesquita, Miguel Ângelo Martins
dc.subject.por.fl_str_mv Degenerescência Macular da idade
Grânulos autofluorescentes
Doenças Crónicas relacionadas com a idade
Disfunção Lisossomal
Epitélio Pigmentar da Retina
Age-related Macular Degeneration
Autofluorescent granules
Chronic age-related diseases
Lysosome dysfunction
Retinal Pigmented Epithelium
Ciências Médicas
topic Degenerescência Macular da idade
Grânulos autofluorescentes
Doenças Crónicas relacionadas com a idade
Disfunção Lisossomal
Epitélio Pigmentar da Retina
Age-related Macular Degeneration
Autofluorescent granules
Chronic age-related diseases
Lysosome dysfunction
Retinal Pigmented Epithelium
Ciências Médicas
description RESUMO:O declínio da função lisossomal tem sido apontado como estando envolvido numa série de doenças crónicas relacionadas com a idade, nomeadamente em doenças neurodegenerativas, cancro, aterosclerose e retinopatias. Neste projeto colocamos a hipótese de que lisossomas disfuncionais adquirem propriedades únicas e marcadores específicos, distinguindo-se dos funcionais. Durante este trabalho, usámos o epitélio pigmentar da retina humana como modelo celular para identificar as propriedades intrínsecas de lisossomas disfuncionais. O epitélio pigmentar da retina é responsável pela fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores, necessários ao processamento visual. Desta forma, sugerimos que a disfunção lisossomal nestas células resulta da acumulação dos segmentos externos dos fotorreceptores que consequentemente leva a retinopatias. Durante este trabalho, desenvolvemos três abordagens diferentes para estudar disfunção lisossomal em contextos distintos: uma abordagem baseada na doença, um modelo genético de disfunção lisossomal e uma estratégia farmacológica. Estas abordagens constituem modelos chave para estudar marcadores comuns de doença ao combinar os diferentes resultados obtidos em cada uma das estratégias. Além do mais, otimizámos a técnica de purificação de lisossomas baseada na immunocaptura do epítopo HA em células do epitélio pigmentar da retina, o que nos permite uma análise detalhada do proteoma de lisossomas purificados de células do epitélio pigmentar da retina e avaliação de novos marcadores de doença. Adicionalmente, projetámos uma estratégia de CRISPR/Cas9 para gerar células estaminais pluripotentes que expressam proteinas lisossomais conjugadas com o epítopo HA. Este último, além de permitir o estudo da disfunção lisossomal, pode também ser usado para estudos de dinâmica lisossomal e interações no ambiente celular. Pretendemos assim estabelecer uma nova interpretação relativamente aos mecanismos moleculares que estão por detrás do desenvolvimento de variadas doenças crónicas relacionadas com a idade, ao combinar as estratégias aqui desenvolvidas com técnicas de proteómica. Deste modo pretendemos identificar novos alvos terapêuticos bem como desvendar mecanismos comuns a doenças degenerativas que apresentam declínio na função lisossomal.
publishDate 2021
dc.date.none.fl_str_mv 2021-03-05
2021-03-12
2021-03-05T00:00:00Z
2023-01-29T01:30:35Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10362/113763
TID:202672239
url http://hdl.handle.net/10362/113763
identifier_str_mv TID:202672239
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799138035558776832