Comparative efficacy of CK1 inhibitors and miRNA-loaded exosomes on the recovery of ALS injured microglia

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Barbosa, Rita Jorge
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/63044
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Comparative efficacy of CK1 inhibitors and miRNA-loaded exosomes on the recovery of ALS injured microgliaAmyotrophic lateral sclerosis (ALS)miRNA modulatory strategiesCK1 InhibitorsModulation of Exosomal miRNA cargoMicroglial state signatureTeses de mestrado - 2023Ciências da saúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada pela perda gradual dos neurónios motores (NMs) superiores e inferiores do córtex, tronco encefálico e da medula espinhal. Esta perda resulta numa paralisia muscular e, eventualmente, na morte dos pacientes devido a insuficiência respiratória. Hoje em dia sabe-se que não são os NMs, mas também as células gliais, nomeadamente a microglia, desempenha um papel importante na patofisiologia da ELA. A maioria dos casos desta doença são esporádicos, no entanto, aproximadamente 5 a 10% dos casos têm origem genética. Embora a principal causa da ELA esporádica ainda não ser conhecida, fatores como deficiências no sistema imunitário, exposição tóxica, disfunção mitocondrial ou toxicidade de glutamato podem contribuir tanto para o início como para a progressão da doença. Atualmente, existem apenas alguns fármacos para tratamento da ELA, sendo que na Europa o Riluzole é a única terapêutica aprovada e os fármacos disponíveis apenas melhoram a esperança de vida dos doentes em apenas alguns meses. Existe assim uma urgência na necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas eficazes, bem como estratégias dirigidas a alterações que sejam específicas de cada paciente em diferentes estádios de progressão da doença. Nesse sentido, os microRNAs (miRNAs) surgem como uma aposta promissora, uma vez que podem ser alvo de modulação específica. Os miRNAs são pequenos RNAs não codificantes que interferem com processos transcricionais, translacionais ou epigenéticos através do reconhecimento de regiões cognatas e controlo da expressão de genes. Os miRNAs podem ter um efeito local na célula onde são produzidos, mas também a nível parácrino, uma vez que as células libertam miRNAs para o seu secretoma, onde circulam como moléculas solúveis ou como carga nas suas vesiculas extracelulares, como é o caso das pequenas vesículas extracelulares (de 100-200 nm de diâmetro), aqui referidos como exossomas. Estes exossomas, após absorvidos pelas células alvo, são capazes de assumir o controlo da disponibilidade de RNA e da tradução de proteínas, transformando os miRNAs em alvos promissores para abordagens terapêuticas, uma vez que a sua modulação pode potencialmente beneficiar tanto as células de origem, como as células vizinhas. O nosso grupo de investigação demonstrou que alguns dos miRNAs associados à inflamação (inflamma-miRNAs), nomeadamente o miR-155, miR-21, miR-146a, miR-125b e miR-124 estão alterados em modelos celulares (NMs, microglia e astrócitos) que mimetizam a ELA, bem como no modelo de murganho com sobre-expressão da superóxido dismutase-1 com a mutação G93A. A diferente expressão destes miRNAs poderá estar associada a diversos fenótipos e funções da microglia, contribuindo para o desenvolvimento de neuroinflamação característica da ELA. Em particular, foi demonstrado que o miR-124 está aumentado em NMs com a mutação SOD1 (mSOD1), bem como nos seus exossomas. Foi também observado que restauração dos níveis normais de miR-124 contribui para o restabelecimento da função mitocondrial, axonal e sináptica no NMs, bem como para a produção de um secretoma com efeitos benéficos na microglia, em culturas organotípicas de medula espinhal do ratinho mSOD1 e no próprio animal em estadio inicial da doença. Estes dados apontam o potencial da modulação deste miRNA como estratégia terapêutica. Mais recentemente, foi também observado que a restauração dos níveis normais de miR-125b na microglia mSOD1 promove a recuperação de funções celulares, incluindo a capacidade fagocítica e um equilíbrio homeostático inflamatório. Para além disso, o nosso grupo evidenciou que a microglia envelhecida é menos responsiva ao péptido beta-amilóide em comparação com a microglia jovem, apresentando uma menor capacidade fagocítica, migração microglial e propriedades autofágicas, bem como um aumento de marcadores associados à senescência e aumento da expressão de miR-146. O nosso grupo demonstrou que exosomas derivados de NMs NSC-34, ricos em miR-124, têm a capacidade de desencadear alterações nas características fenotípicas da microglia, podendo oferecer vantagens na inibição da ativação microglial e dos seus efeitos associados a degeneração dos NMs associados a esta doença. Neste sentido, será importante perceber de que forma as funções da microglia mSOD1 poderão ser recuperadas na presença de modulação de miRNAs específicos. Outra potencial estratégia terapêutica para ELA poderá ser a utilização de inibidores de proteínas cinases, mais especificamente a proteína caseína quinase 1 (CQ1). A CQ1 foi a primeira cinase reconhecida a fosforilar a proteína de ligação ao DNA TAR43 (TDP-43). De facto, estudos recentes demonstram que inibidores, nomeadamente o IGS-2.7 e o IGS-2.37, são capazes de reduzir a fosforilação de TDP-43, e que o IGS-2.7 teve a capacidade de diminuir a reatividade das células astrogliais e microgliais bem como a fosforilação do TPD-43, além de preservar os NMs. Curiosamente, dados preliminares do nosso grupo indicam que o composto IGS-2.7 é capaz de modular a expressão de miR-124 e miR-125b na microglia espinhal isolada de murganhos (dados não publicados), o que também pode constituir uma abordagem promissora a ser considerada para o direcionamento de miRNA na ELA. Desta maneira, este presente estudo visa demonstrar os efeitos da modulação dos níveis da expressão de miR-124 e miR-125b na recuperação da função da microglia, bem como uma comparação entre diferentes estratégias de modulação de miRNA na microglia mSOD1. Para tal, utilizámos culturas primárias de microglia obtida da medula espinhal de murganhos que sobre-expressam mSOD1. Estas culturas foram incubadas com o inibidor IGS-2.7 numa primeira fase, e com exossomas derivados de NMs da linha celular NSC-34, quer WT ou mSOD1, numa segunda fase do trabalho. Em paralelo, os NMs WT foram sujeitos a uma transfeção de forma a conterem no seu cargo anti-miR-124. As incubações na microglia foram realizadas aos 2 dias in vitro (DIV), representando a microglia jovem, ou aos 16 DIV, representando a microglia envelhecida. Relativamente ao efeito do inibidor IGS 2.7, a incubação com o composto reduziu a expressão de miR-124/miR-125b na microglia mSOD1 com 2 e 16 DIV. O IGS-2.7 também foi capaz de reverter os níveis de apoptose tardia, bem como a perda da capacidade fagocítica e o aumento da expressão de TIMP2 e TNF-α na microglia mSOD1 jovem (2 DIV). Por outro lado, o composto IGS 2.7 foi capaz de recuperar o aumento da expressão de Arginase-1 observada nas células mSOD1 envelhecidas (16 DIV). Em seguida, avaliámos os efeitos dos exossomas proveniente de NMs WT/mSOD1 na microglia WT. A incubação com exossomas de NMs de mSOD1 diminuiu a expressão de miR-125b e aumentou os níveis de miR-124 em microglia WT jovem, enquanto apenas aumentou a expressão miR-125b em microglia envelhecida. Quanto aos exossomas de NMs-WT carregados com anti-miR-124, a sua incubação diminuiu a expressão de miR-124 e elevou o miR-125b na microglia mSOD1 jovem, enquanto a sobre-expressão de miR-125b em microglia mSOD1 envelhecida foi restaurada para níveis semelhante aos encontrados nas células WT. Os exossomas carregados com anti-miR-124 também parecem ter um papel imunorregulador, como sugerido pela diminuição da expressão de Arginase-1/iNOS e aumento de TREM2/ TMEM119 em microglia mSOD1 jovem, e ligeira diminuição de TNF-α e aumento de TMEM119 em microglia mSOD1 envelhecida quando as células são incubadas com estes exossomas. Em conclusão, propomos que a sobreativação da microglia mSOD1 pode ser revertida, pelo menos em parte, pela modulação do miR-124 e que os benefícios do inibidor da CK1 podem ser parcialmente devidos à modulação do miR-124 e do miR-125b.Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder affecting motor neurons (MNs), although microglia deregulation is also critical. Our data showed that inflammatory-associated miRNAs, namely miR-124 and miR-125b are upregulated in microglia isolated from the spinal cord of mice overexpressing G93A mutation in superoxide dismutase-1 (mSOD1). We also demonstrated miR-124 is upregulated in ALS mSOD1 MNs and in their secretome/exosomes and that anti-miR-124 prevents disease progression, and show promises a therapeutical approach. Another promising strategy is the use of protein kinase 1 (CK1) inhibitors, as IGS-2.7, but their effects in ALS microglia are still unknown. Here, we explored the effects of the IGS-2.7 on miR-124/miR-125b expression, cellular function and immune homeostasis on mSOD1 microglia, when using young/activated (2-days in vitro, 2DIV) or aged/dormant (16DIV) cells. Incubation with IGS-2.7 downregulated the expression of miR-124/miR-125b in mSOD1 microglia in both 2 and 16 DIV IGS-2.7 also recovered the late apoptosis, phagocytic capacity and TIMP2 and TNF-α expression in young mSOD1 microglia, and Arginase-1 expression in aged mSOD1 cells. We next evaluated the effects of exosomes from WT/mSOD1 MNs in microglia. Incubation with mSOD1 MN exosomes decreased the expression of miR-125b and increased miR-124 in young WT microglia, while only increased miR-125b in aged ones. As for WT-MNs exosomes loaded with anti-miR-124, its incubation decreased miR-124 expression and elevated miR-125b in young mSOD1 microglia, while miR-125b upregulation in mSOD1 aged microglia was restored. Exosomes-loaded with anti-miR-124 also appeared to have an immunoregulatory role, indicated by the decreased expression of Arginase-1/iNOS and increased TREM2/ TMEM119 in young mSOD1 microglia, and slightly decreased TNF-α and increased TMEM119 in aged mSOD1 microglia. Overall, we propose that mSOD1 microglial overactivity can be reverted, at least in part, by miR-124 modulation and that CK1 inhibitor benefits may be partially due to miR-124 and miR-125b modulation.imed - Research Institute for Medicines.Botelho, Ana Rita Mendonça VazBrites, Dora Maria Tuna de OliveiraRepositório da Universidade de LisboaBarbosa, Rita Jorge2023-12-192023-10-272026-12-19T00:00:00Z2023-12-19T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/63044TID:203466594enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-04T01:21:06Zoai:repositorio.ul.pt:10451/63044Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:12:34.431041Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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