Detecção de alterações de miRNAs relacionados ao câncer colorretal utilizando sensores de carga e massa

• Autor(a) principal: Dellevedove, Stephanie Lisboa
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59135/tde-18022019-105254/
• topic: Electrochemical; Eletroquímica; miRNA; miRNA; QCM; QCM

O câncer colorretal é uma das malignidades com maior incidência no Brasil e, na maioria dos casos, tem poucos sintomas visíveis até a doença estar em um estágio avançado. Pensando em simplificar o procedimento do exame e fazer um diagnóstico mais rápido para pacientes com câncer colorretal, este estudo teve como objetivo desenvolver um processo de diagnóstico simplificado baseado na caracterização de um biossensor eletroquímico em que fitas simples de miRNAs de interesse foram imobilizadas na superfície de eletrodos de ouro com objetivo de fazer a detecção de sua fita complementar utilizando-se dos métodos de espectroscopia de impedância eletroquímica e microbalança de cristal de quartzo. A sequência que foi imobilizada foi uma sequência de DNA que corresponde ao miRNA-224, cuja elevada expressão foi recentemente correlacionada com a agressividade e a incidência de metástase em pacientes com câncer colorretal. Os dados obtidos através da técnica de EIS foram comparados a dois modelos físicos de circuito equivalente, o circuito Randles clássico e um circuito Randles modificado, onde o capacitor foi substituído por um elemento de fase constante, tentando modelar de maneira mais eficiente a dupla camada que se forma na região de contado do eletrodo com a solução eletrolítica. O modelo modificado apresentou uma janela de funcionamento de 40,11% enquanto o circuito original apresentou uma janela de funcionamento de 23,98%; o que juntamente com o embasamento teórico do modelo de dupla camada fez com que o circuito modificado tenha sido escolhido para modelar os dados dos experimentos feitos na sequência. Tendo em vista que a imobilização das fitas simples de DNA na superfície do eletrodo de ouro é o passo chave para a obtenção de uma resposta satisfatória no biossensor, foram feitos testes alterando a proporção de DNA e espaçadores na fase de funcionalização a fim de determinar qual a proporção que otimiza a resposta do sensor. Comparando os resultados obtidos para as proporções de ssDNA:tiol total na etapa de funcionalização do eletrodo de 1:3, 1:4 e 1:5, a proporção 1:4 que corresponde a 20% de amostra no buffer de imobilização foi a que levou a uma maior variação percentual dos valores de Rct devido às hibridizações. Considerando esses como sendo os parâmetros otimizados para o sistema, foi construída então uma curva de caracterização do sensor, e o limite de detecção encontrado foi de 10pM; um valor considerado alto comparado com outros experimentos semelhantes, entretanto deve-se lembrar que o sistema aqui estudado não fez o uso de elementos amplificadores, como nanopartículas ou intercaladores de DNA. Para fins de comparação entre técnicas, foi conduzida uma análise semelhante utilizando uma microbalança de cristal de quartzo. Inicialmente foram utilizados os parâmetros encontrados como otimizados para a EIS, e posteriormente foram usados parâmetros mais próximos aos otimizados para essa técnica encontrados na literatura. Em ambos os casos foi possível observar variações referentes à hibridização das fitas complementares, entretanto como esperado, a resposta se mostrou mais expressiva para o segundo caso. Essas diferenças de resposta puderam ser relacionadas aos diferentes princípios de funcionamento dos sensores nas duas técnicas, mostrando que para a QCM o fator que influencia na resposta está relacionado à quantidade total de amostra imobilizada na superfície do eletrodo, enquanto que para a técnica de EIS o mais relevante é o quão compacta a camada se mostra.