Repercussão funcional da expressão dos receptores A2A, NK1 e M3 em várias subpopulações celulares no plexo mioentérico do íleo de rato

• Autor(a) principal: Silva, Isabel Sofia Dias da
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10348/2194

O sistema nervoso entérico (SNE) é formado por uma extensa rede neuronal intrínseca que acompanha todo o tracto gastrointestinal e que se organiza em dois grandes plexos nervosos; o plexo submucoso ou de Meissner (mais interno, localizado na submucosa) e o plexo mioentérico ou de Auerbach (mais externo, localizado entre as duas camadas musculares circular e longitudinal). O SNE possui numerosas células gliais e intersticiais de Cajal (ICC), que em conjunto com os neurónios controlam funções essenciais como a motilidade, secreção e fluxo sanguíneo intestinal. A motilidade gastrointestinal é regulada pela libertação de acetilcolina (ACh), de purinas (e.g. ATP, adenosina) e de taquicininas (e.g. Substância P) a partir de neurónios entéricos excitatórios (Furness, 2000). Por outro lado, tanto as células gliais como as intersticiais de Cajal estão envolvidas no metabolismo dos neurotransmissores e são capazes de libertar substâncias neuromoduladoras. O equilíbrio entre a activação de neurónios excitatórios e/ou inibitórios, das células não-neuronais adjacentes e das células efectoras (musculares, glandulares ou vasculares) determina a actividade funcional do intestino em cada momento. Substâncias irritantes como a capsaicina, um composto isolado da malagueta vermelha, favorecem a transmissão neuromuscular devido à libertação maciça de taquicininas e da sua actuação sobre receptores NK1 e NK3 localizados em células neuronais e não-neuronais (Holzer et al., 2007). A injecção neonatal de capsaicina causa a degenerescência das fibras nervosas peptidérgicas (tipo C) por depleção do neurotransmissor e pelo influxo de grandes quantidades de Ca2+, resultando na perda de sensação dolorosa e da contractilidade do músculo liso (Geber et al., 2006). O ATP libertado conjuntamente com a ACh após estimulação nervosa é rapidamente metabolizado em adenosina através de uma cascata de ecto-nucleotidases. Recentemente, foi demonstrado que a adenosina possui uma acção bifásica no plexo mioentérico do íleo de rato. A adenosina actua em receptores inibitórios A1 presentes nos neurónios mioentéricos, taquicinérgicos e colinérgicos (Broad et al., 2002), enquanto a activação dos receptores A2A facilita a libertação de ACh induzida por estimulação eléctrica (Duarte-Araújo et al., 2004). Foi, também, demonstrada a existência de receptores muscarínicos M3 capazes de facilitarem a libertação de ACh indirectamente através do aumento do transporte de adenosina para o meio extracelular, facto que favorece a activação dos receptores facilitatórios A2A (Vieira et al., 2009). Sabendo que os receptores purinérgicos, taquicinérgicos e colinérgicos favorecem a neurotransmissão e a motilidade intestinal, pareceu-nos interessante investigar a interacção funcional destes receptores manipulando a sua actividade por métodos farmacológicos e/ou causando a depleção (> 95%) dos neurónios peptidérgicos através da injecção neonatal de capsaicina (RTC) em preparações de plexo mioentérico - músculo longitudinal (PM-ML) do íleo de rato. Para o esclarecimento dos objectivos propostos utilizaram-se várias metodologias: (1) quantificação da libertação de ACh- [3H] (Duarte-Araújo et al., 2004) e de substância P (por ELISA) induzida por estimulação eléctrica de campo (5 Hz, 1 ms), (2) registos miográficos em resposta à aplicação de antagonistas muscarínicos e taquicinérgicos e (3) ensaios de imunolocalização destes receptores por microscopia confocal usando sondas fluorescentes. Comparando os dois grupos de animais utilizados, ratos controlo (RC) e ratos tratados com capsaicina no período neonatal (RTC), não se observaram diferenças significativas na quantidade de SP extraída das preparações de PM-ML, porém foi possível observar um decréscimo na quantidade de SP libertada após estimulação eléctrica do PM-ML nos animais RTC. Esta redução foi também detectada na presença do agonista selectivo dos receptores A2A da adenosina, CGS21680C (3nM), e do agonista dos receptores muscarínicos M3, oxotremorina (Oxo, 300μM). Observou-se, ainda, uma redução significativa da imunorreactividade para os neuropéptidos, CGRP e SP, no plexo mioentérico do íleo dos RTC comparativamente com o grupo controlo, confirmando a eficácia do tratamento com capsaicina no período neonatal. O agonista dos receptores NK1, [Sar9,Met(O2)11]-Substance P, (s,m-SP, 300nM), causou um pequeno aumento (16±4%, n=4) da libertação de ACh-[3H] a partir do PMML estimulado electricamente. O efeito facilitatório deste análogo da SP foi significativamente potenciado pela activação conjunta dos receptores A2A da adenosina pelo CGS21680C (3nM), i.e. a libertação de ACh-[3H] aumentou para 48±8% (n=4) quando se aplicou s,m-SP (300nM) na presença de CGS21680C (3nM). A potenciação do efeito facilitatório do s,m-SP (300nM) sobre a libertação de ACh-[3H] foi também observada na presença do activador directo da adenilciclase, FSK (3μM, 31±6%, n=4), e do inibidor da desaminase da adenosina, EHNA (50μM, 27±6%, n=5), a enzima que converte a adenosina no seu metabolito inactivo, inosina. De forma análoga, o efeito facilitatório do CGRP (200nM, 19±5%, n=4) sobre a libertação de ACh-[3H] induzida por estimulação eléctrica só atingiu significado estatístico na presença de CGS21680C(3nM, 25±6%, n=4) ou de forscolina (3μM, 27±4%, n=4). Estes resultados sugerem a existência de um sinergismo entre a actividade excitatória dos neuropéptidos e a activação tónica de receptores A2A acoplados positivamente à via de transdução de sinal dependente da adenilciclase (AC) no controlo da libertação de ACh-[3H] no PM-ML. Através de ensaios de imunofluorescência comprovou-se a existência de receptores A2A da adenosina nas terminações nervosas colinérgicas do plexo mioentérico que exibem imunorreactividade para o transportador vesicular da ACh, VAChT. A densidade de marcação dos receptores A2A da adenosina não parece sofrer alteração nos animais RTC, comparativamente com o grupo controlo. O mesmo não se verificou relativamente à actividade do agonista dos receptores A2A da adenosina, CGS21680C (3nM). Este composto causou um aumento da libertação de ACh-[3H] de 53±10% (n=5) e de apenas 11±7% (n=6) nos animais RC e RTC, respectivamente. No entanto, o efeito facilitatório do CGS21680C (3nM) nos animais RTC foi restabelecido para níveis semelhantes ao controlo (46±17%, n=6) após a aplicação conjunta do agonista A2A e do análogo da SP, s,m-SP (300nM). Estes resultados sugerem que, para além do sinergismo entre os efeitos desencadeados pela activação dos receptores A2A e NK1, a existência de proximidade estrutural entre estes dois tipos de receptores. A imunorreactividade contra os receptores NK1 foi detectada apenas em alguns corpos celulares dos neurónios ganglionares do plexo mioentérico e nas células intersticiais de Cajal intramusculares (ICC-IM, de morfologia fusiforme), mas não nas suas congéneres localizadas junto ao gânglio mioentérico (ICC-MY, de morfologia estrelada), embora ambas apresentem marcação positiva para o anticorpo antivimentina. É interessante realçar que o padrão de marcação dos receptores NK1 varia nos dois grupos de animais estudados. Nos animais controlo, esta marcação encontra-se dispersa pelo citoplasma correspondendo a receptores internalizados (dessensibilizados), enquanto os animais RTC apresentam um padrão de marcação membranar com predomínio de receptores activos. O padrão de distribuição celular dos receptores NK1 correlaciona-se com a abundância ou a depleção do ligando endógeno, SP, nos animais RC ou RTC, respectivamente. Foi demonstrado que os neurónios ganglionares com imunorreactividade para os receptores NK1 também apresentavam marcação para a síntase do NO (NOS, 85%) e para a colina acetiltransferase (ChAT, 15 %) (Lomax et al., 1998). Assim, avaliou-se o papel do NO sobre a libertação de ACh- [3H] a partir do PM-ML do íleo de rato. A manipulação da via do NO, usando o seu precursor, L-arginina (L-arg, 470μM), o dador directo de NO, SIN-1 (10μM) e o inibidor irreversível da NOS, L-NAME (300μM), não alteraram significativamente a libertação de ACh-[3H] induzida por estimulação eléctrica, demonstrando que os receptores NK1 envolvidos no efeito excitatório da SP no plexo mioentérico não se encontram localizados em neurónios nitrérgicos. Recentemente, foi demonstrado que a activação de receptores muscarínicos do subtipo M3 favorece a libertação de ACh-[3H] no PM-ML do íleo de ratos saudáveis através de uma acção indirecta sobre as terminações nervosas colinérgicas mediada pelo efluxo de adenosina e consequente activação dos receptores pré-juncionais A2A (Vieira et al., 2009). No entanto, neste trabalho mostrou-se que o efeito facilitatório do agonista muscarínico (M3), oxotremorina (300μM, 34±4%, n=3), constatado em animais controlo foi abolido (-3±12%, n=6) após o tratamento com capsaicina no período neonatal. Contrariamente ao sinergismo observado entre os receptores A2A e NK1 (ver acima), a aplicação exógena de s,m-SP (300nM) não conseguiu ultrapassar o bloqueio da resposta muscarínica (M3) (-3±7%, n=4), provavelmente por défice na libertação de adenosina endógena a partir de células que expressam este receptor. O efeito facilitatório da oxotremorina (300μM) não sofreu alteração significativa na presença do antagonista selectivo dos receptores NK1, L732138 (20nM, 28±9%, n=4). Registos miográficos realizados em preparações de PM-ML do íleo mostraram que o efeito do antagonista selectivo dos receptores muscarínicos M3, J104129 (6nM), não alterou o efeito contracturante da oxotremorina nos animais RTC, contrariamente ao que foi descrito para animais controlo (ver Vieira et al., 2009). Também o bloqueio dos receptores NK1 com L732138 (20nM) não alterou significativamente (P>0.05) o efeito da oxotremorina nos dois grupos de animais, sugerindo a inexistência de interacções NK1-M3 na transmissão mioneural no PM-ML. Estes resultados sugerem que o efeito directo da oxotremorina sobre as fibras musculares lisas é independente do seu efeito neuromodulador, sendo este último mediado pela activação de receptores M3 e consequente libertação de adenosina que activa receptores A2A. Usando técnicas de imunofluorescência, mostrou-se que os receptores muscarínicos M3 estão localizados predominantemente nas células intersticiais de Cajal (positivas para a vimentina), tanto ao nível ganglionar (ICC-MY) como a nível intramuscular (ICC-IM). No entanto, a densidade de marcação destes receptores está significativamente diminuída nos animais RTC, nomeadamente no que respeita à marcação dos receptores M3 nas ICC-IMs. Estes resultados contrastam com o padrão de marcação dos receptores NK1 neste grupo de animais, onde se observa um aumento da imunorreactividade destes receptores associado à sua distribuição membranar. Em conclusão, os resultados obtidos confirmam a existência de um sinergismo na actuação dos receptores A2A e NK1 na regulação da libertação de ACh a partir das terminações nervosas mioentéricas. Os receptores NK1 parecem estar co-localizados com os receptores muscarínicos M3 nas ICC-IM, que se encontram justapostas entre as terminações nervosas colinérgicas (marcadas com VAChT) e/ou peptidérgicas (reactivas para a SP) e as fibras musculares lisas – sinapse tripartida. Nos animais RTC, observaram-se alterações estruturais e funcionais no plexo mioentérico do íleo de rato, das quais se destacam: (1) a redução da densidade e da função neuromoduladora dos receptores M3 das ICC-IM, mas não das ICC-MY, (2) a translocação dos receptores NK1 do citoplasma para a membrana das células para compensar a depleção do seu ligando endógeno, a SP, e (3) o défice na actividade tónica dos receptores facilitatórios A2A da adenosina. A redução da facilitação da libertação de ACh devida aos receptores A2A nos animais RTC correlaciona-se com baixos níveis endógenos do nucleósido resultantes da perda de receptores M3 e/ou com a redução do teor tecidular em taquicininas (e.g. SP) e, consequente, perda do efeito sinérgico A2A e NK1. A razão da perda selectiva de receptores muscarínicos M3 das ICC-IM nos animais RTC pressupõe uma relação entre os neuropéptidos e a expressão de receptores muscarínicos nessas células que carece de comprovação experimental.