ALS pathogenesis: role of motor neuron-derived exosomes in microglia activation and dysfunction
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| Data de Publicação: | 2016 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/34358 |
Resumo: | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016 |
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ALS pathogenesis: role of motor neuron-derived exosomes in microglia activation and dysfunctionExosomesAmyotrophic lateral sclerosisMicroglia activation/dysfunctionNeuroinflammation-associated mediatorsMicroRNA profilingTeses de mestrado - 2016Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016Exosomes are nanosized (30-100 nm) extracellular vesicles that are formed by nearly all types of cells and derive from the endocytic pathway and intracellular multivesicular bodies. They are released when the multivesicular bodies fuse with the plasma membrane. Exosomes mediate intercellular communication and have an important role in the spreading of neurodegenerative diseases, probably also of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Recently, release of exosomes derived from motor neuron (MN)-like NSC-34 cells overexpressing human superoxide dismutase 1 mutated in G93A (mSOD1), was suggested to be implicated in cell-to-cell transfer of mSOD1 toxicity. However, how the uptake of such exosomes by receptor cells, such as microglia, contributes to their activation or loss of function was never investigated. Here we evaluated a selected set of promising markers and mediators of inflammatory response to establish: (i) the pro- and anti-inflammatory microRNA profile in NSC-34 MN-like cell line and in their derived exosomes; (ii) alterations in microglia function and generated polarized microglia subtypes triggered by the mSOD1 MN-derived exosomes; and (iii) the cellular distribution of labelled exosomes in a MN-microglia co-culture system. For that, we used mouse NSC-34 cells expressing either wild-type SOD1 (wt) or the G93A mutation (mSOD1) and the mouse N9 microglial cell line. Exosomes were isolated from the cell culture medium by differential ultracentrifugation and incubated with microglia for 2, 4 and 24 hours, or with the MN-microglia co-cultures for 24 hours. We assessed microglia phagocytic ability and senescence, nitric oxide (NO) production, matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 activity in the extracellular media, nuclear factor-kappa B (NF-κB) activation, and gene and microRNA expression by quantitative Real-Time PCR. We observed that the overexpression of microRNA (miR)-124 in mSOD1 MNs was reproduced in their derived exosomes. Such exosomes led to a loss of microglia phagocytic ability, acute release of NO, MMP-2 and MMP-9, and interleukin (IL)-1β and tumor necrosis factor (TNF)-α expression, together with lasting NF-κB activation and delayed increase of senescent-like cells. Interestingly, the early decrease in miR-124 and miR-146a expression induced by both types of exosomes was followed by their increase after 24 hours of incubation with the mSOD1 MN-derived exosomes, where enhanced miR-155 expression was similarly observed. Finally, we observed that the distribution of exosomes was preferentially towards microglia than to MNs, in the co-culture system. Preliminary data also suggest that mSOD1-associated exosomes increase the microglial expression of IL-1β and TNF-α, together with that of alarmin HMGB1. However, further studies are needed to confirm and assess the relevance of these pilot results. Overall, data highlight exosomes from mSOD1 MNs as inducers of microglia activation and dysfunction, different microglia subsets and inflammatory mediators’ production.Exossomas são nano-vesículas extracelulares (30-100 nm) formadas por praticamente todos os tipos de células e que derivam da via endocítica e corpos multivesiculares intracelulares. Estas vesículas são libertadas aquando da fusão do corpo multivesicular com a membrana plasmática das células. Os exossomas mediam a comunicação intercelular e têm um papel importante na disseminação de doenças neurodegenerativas, como possivelmente a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA). Recentemente foi proposto o envolvimento de exossomas provenientes das células motor neuron-like NSC-34, transfetadas com a superóxido dismutase 1 humana com mutação em G93A (mSOD1), na propagação da toxicidade desta proteína. Contudo, o efeito da incorporação destes exossomas pelas células recetoras, tal como as células de microglia, na sua ativação ou perda de função nunca foi investigado. No presente estudo, pretendeu-se avaliar um conjunto específico de marcadores e mediadores da resposta inflamatória, de forma a estabelecer: (i) o perfil de microRNAs pro- e anti-inflamatórios na linha celular NSC-34 e nos seus respetivos exossomas; (ii) alterações na funcionalidade das células de microglia, assim como os diferentes subtipos de polarização desencadeados pela exposição aos exossomas provenientes dos neurónios motores mSOD1; e (iii) a distribuição celular de exossomas marcados num sistema de co-cultura neurónios-microglia. Para isso, foram usadas células NSC-34 que expressam tanto a proteína SOD1 normal (wt) como mutada em G93A (mSOD1) e a linha celular de microglia N9. Os exossomas foram isolados do meio de cultura celular por ultracentrifugação diferencial e incubados com a microglia durante 2, 4 e 24 horas, ou nas co-culturas durante 24 horas. Os parâmetros avaliados foram a capacidade fagocítica da microglia e a sua senescência, produção de óxido nítrico (NO) e atividade das metaloproteinases (MMP)-2 e MMP-9 no meio extracelular, ativação do factor nuclear-kappa B (NF-κB), e expressão génica e de microRNAs por PCR quantitativo em tempo real. Nos neurónios motores mSOD1 foi observada a sobre-expressão do microRNA (miR)-124, que se reproduziu nos exossomas provenientes destas células. Estes exossomas induziram a perda da capacidade fagocítica da microglia, libertação aguda de NO, MMP-2 e MMP-9, e expressão da interleucina (IL)-1β e factor de necrose tumoral (TNF)-α, juntamente com a ativação prolongada do NF-κB e aumento tardio do número de células do tipo senescente. Curiosamente, a diminuição inicial na expressão do miR-124 e miR-146a induzida pelos dois tipos de exossomas foi seguida pelo seu aumento após 24 horas de incubação com os exossomas dos neurónios motores mSOD1, sendo igualmente observado o aumento da expressão do miR-155. Por fim, verificou-se que, quando em sistema de co-cultura, os exossomas são preferencialmente internalizados pelas células da microglia do que pelos neurónios motores. Dados preliminares sugerem ainda que os exossomas associados aos neurónios mSOD1 aumentam a expressão de IL-1β e TNF-α na microglia, juntamente com a alarmina HMGB1. No entanto, são necessários mais estudos que confirmem e atestem a relevância destes resultados. Os resultados obtidos evidenciam os exossomas derivados dos neurónios motores mSOD1 como indutores de ativação e disfunção da microglia, assim como diferentes subconjuntos de microglia e produção de mediadores inflamatórios.The work presented in this master thesis was supported by Santa Casa da Misericórdia de Lisboa (ELA Project 2016) and by Fundação para a Ciência e Tecnologia – FCT, Portugal (UID/DTP/04138/2013 to iMed.ULisboa, SFRH/BPD/76590/2011 to Vaz A.R., SFRH/BD/91316/2012 to Cunha C. and SFRH/BD/102718/2014 to Gomes C.).Brites, DoraBotelho, Ana Rita Mendonça VazRepositório da Universidade de LisboaPinto, Sara Filipa Castro da Costa2018-11-23T01:30:17Z2016-11-232016-09-202016-11-23T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/34358TID:201487250enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:29:37Zoai:repositorio.ul.pt:10451/34358Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:49:05.131159Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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