Caracterização genética da glucano sintetase de Pneumocystis jirovecii

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: CASTRO, Rafaela Dorileo de
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/15340
Resumo: Pneumocystis jirovecii é um micro-organismo fúngico que pode causar pneumonia em doentes imunocomprometidos. O ciclo de vida de Pneumocystis inclui uma forma biológica trófica e outra quística na qual estão presentes, em sua composição, hidratos de carbono chamados β-Glucanos. Estes componentes são liberados na corrente sanguínea após lise do micro-organismo pela resposta imunitária ou fármacos, sendo assim, considerado um marcador sorológico que atua como auxiliar no diagnóstico da PPc. Porém, este marcador não é específico para o gênero Pneumocystis, podendo ser um teste positivo em outras infecções fúngicas como a candidíase. Caracterizar a sequência genética da Glucano Sintetase permite uma nova abordagem em relação aos testes sorológicos e a possíveis novos alvos terapêuticos. Um teste sorológico para o β-Glucano específico para P. jirovecii podendo ser um marcador muito mais útil e confiável do que os utilizados atualmente. Neste trabalho foi feita a caracterização genética do fragmento correspondente à Glucano Sintetase de P. jirovecii com base na sequência de β-Glucano de P. carinii e na sequência completa de P. jirovecii através de metodologias de PCRs. Com o resultado do sequenciamento do fragmento de β-Glucano de P. jirovecii puderam ser observadas possíveis bases candidatas a polimorfismos de base única (SNP). Determinar os polimorfismos em uma sequência resulta em conhecimento da diversidade genética do micro-organismo para além de reconhecer marcadores moleculares que podem determinar sua origem geográfica, resistência a fármacos e fatores de virulência. Duas bases foram identificadas na sequência como possíveis SNPs. Estudos em projetos futuros com técnicas como o RFLP podem caracterizar e determinar as consequências e importância destes polimorfismos no fragmento da Glucano Sintetase de P. jirovecii. Estabelecer esta importância pode levar à compreensão do modelo de infecção e defesa deste micro-organismo para que possamos perceber melhor sua atuação
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Um teste sorológico para o β-Glucano específico para P. jirovecii podendo ser um marcador muito mais útil e confiável do que os utilizados atualmente. Neste trabalho foi feita a caracterização genética do fragmento correspondente à Glucano Sintetase de P. jirovecii com base na sequência de β-Glucano de P. carinii e na sequência completa de P. jirovecii através de metodologias de PCRs. Com o resultado do sequenciamento do fragmento de β-Glucano de P. jirovecii puderam ser observadas possíveis bases candidatas a polimorfismos de base única (SNP). Determinar os polimorfismos em uma sequência resulta em conhecimento da diversidade genética do micro-organismo para além de reconhecer marcadores moleculares que podem determinar sua origem geográfica, resistência a fármacos e fatores de virulência. Duas bases foram identificadas na sequência como possíveis SNPs. Estudos em projetos futuros com técnicas como o RFLP podem caracterizar e determinar as consequências e importância destes polimorfismos no fragmento da Glucano Sintetase de P. jirovecii. Estabelecer esta importância pode levar à compreensão do modelo de infecção e defesa deste micro-organismo para que possamos perceber melhor sua atuaçãoPneumocystis jirovecii is an important opportunistic agent that causes one of the most severe respiratory infections in immunocompromised patients, known as Pneumocystis pneumonia (PcP). Although PcP is commonly associated with HIV infection, the numbers of PcP cases and P. jirovecii asymptomatic carriers are increasing among HIV seronegative patients with other predisposing immunodeficiencies. In the last decades, molecular techniques have allowed the detection of very low burdens of P. jirovecii, usually not detectable by the classic microscopic methods. The aim of this study was to determine the frequency of P. jirovecii infection in HIV seronegative and seropositive Portuguese patients from a community central hospital in Lisbon, using molecular approaches. A total of 300 respiratory specimens were obtained from 274 (91.3%) HIV seronegative and 26 (8.7%) HIV seropositive patients. Of the 274 HIV seronegative patients, underlying medical conditions included: 139 malignancies, 45 chronic obstructive pulmonary diseases (COPD), 37 pneumonias (not PcP), 17 tuberculosis (TB), 16 autoimmune diseases, nine solid-organ transplantation and 11 other causes. Of the 26 HIV seropositive patients, 10 had clinical suspicion of PcP and the remaining 16, other medical causes. All samples were analyzed by real-time PCR (RT-qPCR) targeting the P. jirovecii nuclear single-copy kexin-like serine protease (KEX1) gene and by nested-PCR directed to the P. jirovecii mitochondrial multicopy large-subunit rRNA (mtLSU rRNA) gene. The analysis of the results, indicate that P. jirovecii DNA was detected in 119 (39.7%) patients of the studied population (98, 35.8% HIV seronegative; 21, 80.8% HIV seropositive); 51 (36.7%) malignancies, 20 (44.4%) COPD, nine (24.3%) pneumonias (not PcP), one (5.9%) TB, five (31.2%) autoimmune diseases, eight (88.9%) solid-organ transplantation and four (36.4%) other causes. Among the HIV seropositive patients, P. jirovecii DNA was detected in 10 (100%) with clinical suspicion of PcP and 11 (68.8%) of patients with other causes. There was a statistically significant association between solid-organ transplantation HIV seronegative (P = 0,003) patients and HIV positive (P <0.001) patients and the presence of P. jirovecii DNA. The RT-qPCR assay detected 55 positive samples (18.3%), whereas the nested-PCR assay detected 108 positives ones (36%). A concordance of results was observed in 225 (75%) samples. The RT-qPCR showed a specificity of 94.3% and sensitivity of 40.7%, with a positive predictive valor of 80%, using the nested-PCR as reference standard. The lowest CT values corresponded to HIV seronegative patients undergoing organ transplantation, and HIV seropositive patients symptomatic for PcP. This work confirms the importance of the HIV seronegative (with other predisposing immunodeficiency) and HIV seropositive patients colonized by P. jirovecii in a hospital environment. This population is at risk of developing PcP or may transmit the pathogen to other susceptible patients, and may play an important role in the circulation and transmission of the organisms in the community.Instituto de Higiene e Medicina TropicalMATOS, OlgaGASPAR, Jorge FranciscoRUNCASTRO, Rafaela Dorileo de2015-08-21T16:11:00Z201420142014-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10362/15340TID:201129418porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-05-22T17:19:06Zoai:run.unl.pt:10362/15340Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-05-22T17:19:06Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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