Characterization of cdkn2b gene during zebrafish development

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Crespo, Cátia Alexandra Vieira
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/9224
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012
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spelling Characterization of cdkn2b gene during zebrafish developmentPeixe-zebraEmbriõescdkn2bDesenvolvimentoAneurismasTeses de mestrado - 2012Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012CDKN2B (inibidor de quinase dependente de ciclina 2B), também conhecido como INK4b ou p15INK4b, é um dos membros da família INK4 (CDK inibidores) e, é conhecido pelo seu papel em processos de proliferação celular, envelhecimento, e função como supressor de tumores. Nos seres humanos, o CDKN2B está numa região em que foi identificado um novo locus associado com o risco de desenvolver aneurismas intracranianos (locus 9p21) em diferentes populações europeias e na população japonesa. Aneurisma intracraniano ocorre da dilatação de um vaso sanguíneo causada por doença ou enfraquecimento da parede do vaso. Apesar dos recentes avanços das técnicas moleculares, os mecanismos de iniciação dos aneurismas intracranianos, progressão e rutura dos mesmos ainda são mal compreendidos, bem como o possível papel do locus 9p21 para os mecanismos subjacentes de aneurismas intracranianos não é conhecido. Com o objetivo de superar a complexidade da etiologia genética humana e, de perceber o possível envolvimento deste locus na formação de aneurismas intracranianos, fomos estudar um ortólogo do gene CDKN2B (cdkn2b) no peixe-zebra, um modelo animal muito atrativo para estudar vertebrados. O peixe-zebra possui uma combinação de vantagens que o tornam um modelo ideal. Além de ser um vertebrado, e, portanto, mais perto do humano do que os modelos de invertebrados, o peixe-zebra tem elevada fecundidade (algumas centenas de ovos por desova), os embriões são transparentes e desenvolvem-se externamente. Ao contrário dos embriões de muitos outros vertebrados, os embriões são acessíveis à observação e manipulação em todas as fases do seu desenvolvimento e, possuem um tempo de gestação curto (2-3meses até serem adultos). Além disso, os peixe-zebra adultos também podem ser facilmente visualizados e manipulados experimentalmente. Para além de todas estas vantagens do modelo do peixe-zebra para o estudo do desenvolvimento em vertebrados, este também é um bom modelo para o estudo da biologia vascular. Isto deve-se à existência de uma linha transgénica de peixes-zebra (fli1a:EGFP) que contem um repórter (GFP) associado aos vasos sanguíneos, possibilitando assim a observação dos vasos durante todo o desenvolvimento do embrião. Como as informações sobre o gene cdkn2b no peixe-zebra são escassas, começámos por proceder à sua caracterização durante os primeiros estadios de desenvolvimento (24, 48 e 72 horas pós fertilização [hpf]) em peixes-zebra AB wt. Para isso utilizámos técnicas de hibridação in situ para caracterizar a expressão de mRNA do cdkn2b e, de imunohistoquímica na caracterização da expressão proteica. Em seguida, de forma a tentar perceber qual a função do gene, fizemos o knockdown do mesmo através da injeção de morfolinos, uma técnica muito utilizada nos dias de hoje para o knockdown de genes em peixes-zebra. Dado que um dos objetivos deste projeto era ainda estudar a possível relação entre o cdkn2b e a formação dos vasos sanguíneos durante o desenvolvimento do peixe-zebra, o knowkdown do cdkn2b através da injeção de morfolinos, foi feito não só em AB wt, mas também em peixe-zebra fli1a:EGFP. Começámos a caracterização do cdkn2b através do estudo da expressão do mRNA em AB wt. Em todos os time-points analisados (24, 48 e 72 horas pós fecundação), o cdkn2b apresentou expressão sobretudo na cabeça dos embriões. Mais especificamente, às 24hpf foi visível expressão no cérebro e na mesoderme da cabeça do peixe. Relativamente às 48hpf e 72hpf apenas podemos concluir que é expresso na cabeça do peixe, no entanto não é possível saber a sua localização exata. Além da expressão de mRNA do cdkn2b, também é importante caracterizar a expressão da proteína. Por observação dos resultados, concluímos que existe expressão generalizada ao nível da epiderme do peixe, especialmente no citoplasma das células. A presença da proteína no citoplasma é consistente com os dados disponíveis desta proteína em peixe-zebra adultos. A camada superficial da epiderme dos peixes é formada por queratinócitos. A partir de estudo in vitro de queratinócitos humanos e no murganho verificou-se que o aumento de TGF-β leva ao aumento do CDKN2B. Uma vez que o CDKN2B é um inibidor das ciclinas CDK4 e CDK6 levando à estagnação da célula na fase G1 do ciclo celular, acreditamos que o cdkn2b pode também ter um papel importante na regulação do ciclo celular na epiderme dos embriões do peixe-zebra. Mais especificamente na estagnação dos queratinócitos existentes na epiderme. Curiosamente, às 48hpf e às 72hpf detetámos a presença de "lacunas de marcação" na epiderme, formando um padrão peculiar de expressão do cdkn2b. A camada mais externa da epiderme do embrião é formado por células vivas, queratinócitos, que não são renovados periodicamente, mas sim substituídas individualmente após a morte celular. Neste sentido, acreditamos que este padrão irregular (a presença das "lacunas de marcação") da expressão do cdkn2b pode dever-se à morte de células na epiderme do embrião e que ainda não tinham sido renovadas aquando o momento da fixação. O facto de termos detetado expressão proteica do cdkn2b na epiderme do embrião não é contraditório com os resultados obtidos na hibridação in situ, tendo em conta que a deteção da expressão de mRNA pode ser insuficiente. Para esclarecer este ponto será necessário fazer hibridação in situ em secções do embrião. Após a caracterização do cdkn2b fomos tentar estudar a função desta proteína no desenvolvimento embrionário. Para isso, decidiu usar-se morfolinos. Após a otimização das quantidades de morfolino a usar concluiu-se que, na ausência de cdkn2b, o fenótipo mais marcante é a curvatura para baixo do eixo do embrião e deformações ao nível da cauda. Embora os embriões tenham sido analisados às 24, 48 e 72hpf, a presença de fenótipo era mais marcante apenas a partir das 48hpf. Após a utilização de um segundo morfolino contra o nosso gene de interesse, a realização de diversos controlos (injecção com morfolino standard, injecção com H2O, co-injecção com o p53 Mo, injecção com p53 Mo) a confirmação do knockdown por imunohistoquímica e, o resgate do fenótipo, aquando da injeção de mRNA de cdkn2b, acreditamos ter fortes evidências da especificidade do fenótipo observado. Em relação à possível relação entre cdkn2b e a formação de vasos sanguíneos, fizemos um knockdown em peixes-zebra transgénicos (fli1a: EGFP ). Isso permitiu-nos analisar os vasos do peixe em detalhe nos estádios de desenvolvimento escolhidos. Às 24hpf, o knockdown do cdkn2b promoveu a deformação da veia caudal assim como em fases posteriores do desenvolvimento embrionário (48hpf e 72hpf). No entanto, permanece a questão se os fenótipos observados na veia caudal são consequência de uma cauda deformada, ou se o cdkn2b está a afetar diretamente a formação do vaso, podendo levar a um fornecimento de sangue deficiente, provocando as deformações observadas durante o desenvolvimento da cauda do peixe. Em conclusão, em embriões de peixes-zebra AB wt o cdkn2b é transcrito principalmente na cabeça do embrião. Ao nível das proteínas, há uma maior expressão na epiderme. Ao injetar um morfolino alvo para bloquear a tradução do cdkn2b, os embriões apresentam uma curvatura do eixo do embrião para baixo e, deformações ao nível da cauda. Isto demonstra a importância deste gene na correta formação do eixo e da cauda do peixe. Quanto aos vasos sanguíneos, são observadas alterações morfológicas ao nível da veia caudal dos transgénicos fli1a: EGFP, aquando do knockdown do cdkn2b. No entanto, serão necessários estudos complementares para entender a relação direta entre o cdkn2b e a formação do eixo do embrião, ou a formação da cauda e dos vasos da cauda.Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (CDKN2B), is known for its role in cell aging, proliferation, and function as a tumor suppressor. In humans, CDKN2B is in a region where a new risk locus associated with intracranial aneurysms was identified. In order to overcome the complexity of human genetic etiology and to study the possible involvement of this locus in aneurysms formation, we have studied an ortholog (cdkn2b) of this gene in the zebrafish, a very attractive model system to study vertebrates. Since there is little information about this gene in zebrafish, we started by characterizing the gene during development of wild-type fish using in situ hybridization and immunohistochemistry techniques. We also did knock-down experiments by injecting morpholinos in fli1a:EGFP zebrafish, a transgenic that has the blood vessels marked with GFP. The gene is transcribed mainly in the cephalic region of the fish. At the protein level, there is higher expression on the epidermis of the fish. When injecting a morpholino, a curly-down body axis with defected tails is formed, and the caudal vein of the fish seems to be affected. This is the first report characterizing cdkn2b expression in Zebrafish embryos and in the correct formation of the tail and vessel mophology of the fish.Abrantes, Patrícia Carla SimõesAfonso, Carla Sofia Fernandes do Amaral Real, 1976-Repositório da Universidade de LisboaCrespo, Cátia Alexandra Vieira2013-09-24T18:09:42Z20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/9224engmetadata only accessinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:53:29Zoai:repositorio.ul.pt:10451/9224Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:29.377415Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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