Estudo dos esfingolípidos complexos em mutantes biossintéticos de Saccharomyces Cerevisiae

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Moreira, Filipe Miguel Palatino
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/26481
Resumo: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
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Uma vez que entre esta estirpe e a estirpe selvagem (wt) não existem variações do conteúdo de ergosterol, a origem desta resistência pode estar nos domínios formados pelos esfingolípidos. Por esta razão, torna-se essencial perceber qual a influência dos esfingolípidos para a organização da membrana plasmática, em particular do M(IP)2C. Com o intuito de perceber esta influência foram realizados estudos biofísicos usando células intatas de ambas as estirpes através de técnicas de espectroscopia de fluorescência. Outro passo essencial para esta compreensão é o estudo biofísico de bicamadas reconstruídas a partir de uma só classe de esfingolípidos, sendo para isso necessária a extração dos lípidos totais da levedura para obter, posteriormente, os esfingolípidos. Para que isto seja possível foi necessária uma otimização não só dos métodos de extração dos lípidos totais a usar, como também do tempo de hidrólise para a obtenção dos esfingolípidos. Foram inoculadas células de estirpes com duplas mutações (csg2Δcsg1Δ e csg1Δcsh1Δ) em meios contendo antifúngicos para testar se com estas mutações (incapacidade de realizar a síntese de manosilinositol fosfoceramida (MIPC) e consequentemente M(IP)2C) as estirpes apresentam resistência a estes mesmos antifúngicos. A caracterização biofísica da membrana plasmática de células intactas de ambas estirpes (wt e ipt1Δ) com a sonda 4-(2-(6-Dibutilamino)-2-naftalenil)etenil)-1-(3-sulfopropil)-piridinina (Di-4-ANEPPS) não reportou diferenças significativas, já que esta sonda responde essencialmente a variações da composição em ergosterol. Os resultados dos estudos de extração e análise de esfingolípidos mostram que os métodos de Ejsing et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. 106: 2136 e de Moehring et al. (2006) J. Mass Spectrom. 41: 372 sãos os mais adequados para a extração de lípidos totais. Mostram também que o tempo mais adequado para a hidrólise dos glicerofosfolípidos e obtenção de esfingolípidos é entre as 6 h e as 8 h. Os ensaios de sensibilidade a antifúngicos mostraram que os duplos mutantes são também resistentes aos mesmos antifúngicos, realçando a importância do M(IP)2C na sensibilidade a estes fármacos. Concluindo, apesar de ainda não se ter obtido cada um dos esfingolípidos complexos de S. cerevisiae na sua forma pura, neste trabalho houve progressos significativos na extração e separação destes lípidos; a sonda utilizada, provavelmente pela sua maior sensibilidade aos efeitos dos esteróis na membrana, não reporta diferenças na organização da membrana na ausência do M(IP)2C. No entanto, observou-se que, tal como as células ipt1Δ, as estirpes com duplas mutações são mais resistentes à nistatina e ao miconazol que as células wt, indicando que a ausência do M(IP)2C na membrana plasmática pode ser fundamental para esta resistência.The yeast Saccharomyces cerevisiae exhibits a composition in ergosterol and sphingolipids in the plasma membrane similar to pathogenic fungi, being ergosterol the main target of chemical agents against these fungi. On another hand, S. cerevisiae cells, such as ipt1Δ deletion mutant, which are unable to synthesize the sphingolipid mannosyl-diinositolphosphoryl-ceramide, M(IP)2C, show greater resistance to antifungal agents, such as miconazole and nystatin. This strain has ergosterol content similar to the wild type (wt) strain. Therefore, the mechanisms of this resistance may involve sphingolipid-enriched domains, namely those that are ergosterol depleted. For this reason, it is crucial to understand the influence of these sphingolipids in the plasma membrane organization, in particular M(IP)2C. To accomplish this goal, biophysical studies were performed with intact cells of both strains using fluorescence spectroscopy techniques. Another important approach to understand this influence is a biophysical one, making use of reconstructed bilayers from a single sphingolipid class. To do so, it was necessary to extract the lipids from yeast to obtain the sphingolipids. An optimization was required, not only for the extraction methods of total lipids but also for the hydrolysis time to obtain the sphingolipids. Moreover, cell strains with double mutations (csg2Δcsg1Δ and csg1Δcsh1Δ) were inoculated in a media containing antifungal agents to test if these mutations (inability to synthetize mannosylinositol phosphorylceramide, MIPC, and therefore M(IP)2C) grant resistance to these same antifungals. The biophysical characterization of the plasma membrane using intact cells of both strains (wt and ipt1Δ) with Di-4-ANEPPS showed no apparent differences because this probe responds mainly to variations in the ergosterol composition. The results show that the Ejsing et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. 106: 2136 and Moehring et al. (2006) J. Mass Spectrom. 41: 372 methods were the most appropriate for the lipid extraction, yet need to be optimized. They also show that the most suitable time for the hydrolysis of glycerophospholipids was between 6 and 8 hours. Antifungal resistance trials showed that strains with double mutations are also resistant to the same drugs, highlighting the importance of M(IP)2C in the sensitivity to these drugs. In summary, even though it was not possible to obtain each one of the S. cerevisiae complex sphingolipids in its pure form, there was a significant progress in the extraction and separation of these lipids in this work; the probe used, probably due to its sensitivity towards sterol effects on membranes, does not report the consequences for membrane organization of the absence of M(IP)2C. However, it was observed that the strains with double mutations, as ipt1Δ cells, are more resistant to nystatin and miconazole than wt cells, indicating that the absence of M(IP)2C in the plasma membrane can play a critical role in this resistance.Almeida, Rodrigo Freire Martins deRepositório da Universidade de LisboaMoreira, Filipe Miguel Palatino2017-02-10T15:21:25Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/26481TID:201690381porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:16:39Zoai:repositorio.ul.pt:10451/26481Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:43:07.920307Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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