Purificação de RNA por cromatografia de afinidade com histidina imobilizada

• Autor(a) principal: Martins, Ana Rita Nunes
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/1767
• topic: RNA 6S; RNA; Cromatografia; Histidina; Geometografia de afinidade

O recente desenvolvimento da terapia génica surge como uma nova abordagem para o potencial tratamento de doenças consideradas incuráveis. Apesar destas estratégias se terem iniciado com DNA, investigações recentes tem avaliado o potencial interesse terapêutico do RNA. No entanto, os protocolos disponível para o isolamento do RNA são limitados, morosos e requerem o uso de solventes tóxicos, o que tornam estes procedimentos inadequados para recuperar o produto a ser biologicamente aplicado. O principal objectivo deste estudo é investigar a aplicabilidade da cromatografia de afinidade com histidina imobilizada no isolamento do RNA. Uma vez que o RNA, tal como o DNA, tem a capacidade de se ligar à matriz de histidina-agarose, esta interacção pode ser explorada para purificar especificamente os diferentes RNAs, atendendo às suas propriedades estruturais. Para concretizar o objectivo, o RNA total foi isolado da Escherichia coli DH5α usando a extracção com tiocianato de guanidina- fenol/clorofórmio e a separação do RNA ribossómico (rRNA) e do RNA de baixo peso molecular (sRNA) foi promovida por precipitação com 2M de sulfato de amónio a 4ºC. Os estudos dos perfis cromatográficos das espécies de sRNA e de rRNA na matriz de histidina-agarose com diferentes concentrações de sulfato de amónio revelaram que para os dois tipos de RNA, as elevadas concentrações de sal promoviam a ligação do RNA à matriz, e a diminuição da força iónica promovia a sua eluição. Com este estudo foi possível desenvolver uma estratégia para a purificação do RNA 6S aplicando um gradiente decrescente de sulfato de amónio por passos. Após a ligação dos sRNAs à matriz de histidina, a diminuição da concentração de sal permite a separação de outros tipos de RNA e a remoção do sal na eluição promove a recuperação do RNA 6S. Este tipo de RNA foi recentemente identificado como estando envolvido no processo de transcrição, pelo que a purificação é uma mais valia para a sua caracterização estrutural e funcional.